Isolamento de Ilhotas Humanos de pacientes parcialmente pancreatectomizado

1. Coleta de tecido pancreático na sala de cirurgia O cirurgião realiza uma ressecção parcial do pâncreas. Depois de colocar a amostra de pâncreas em uma caixa de gelo, entregá-lo imediatamente para o patologista. 2. Seleção de tecidos para isolamento de ilhotas O patologista seleciona tecido que parece macia e saudável, mantendo o tecido danificado para fins de diagnóstico. Tecido fibrótico e espécimes oferecendo menos de 2 g de tecido utilizável são excluídos do isolamento de ilhotas. Mergulhe o tecido pancreático em solução Euro Collins e entregar no gelo para o laboratório. 3. Isolamento de ilhotas humanas Pese o tecido pancreático, em seguida, coloque-o em um prato de 10 cm. Coloque 150 ml RPMI mídia em um balão de 500 ml. Em um frasco de 250 ml, preparar a solução de enzimas digestivas, combinando RPMI 130 ml de mídia com 100 mg / ml DNase e 20 ml de 5mg/ml RI Liberase. Draw 10 ml desta solução para uma seringa para injetar o tecido pancreático. Injetar a solução de enzimas digestivas no tecido pancreático, com o objetivo de distender-lo de forma homogênea. Se este for impedido pela fibrose, a digestão, provavelmente, falhar. Em seguida, mediu o tecido em ~ 4 mm 3 peças no gelo. 4. Circuito digestão humana pâncreas Monte o circuito da digestão, como mostrado na Figura 1. O sentido do fluxo na câmara Ricordi é no fundo e sair no topo da câmara. Adicionar a solução de enzima digestiva restantes para o balão de 500 ml até um volume total de 300 ml e coloque um termômetro. Transferir o tecido pancreático para a câmara, insira o mesh (diâmetro dos poros: 600 mm) e três Marbles nitreto de silício (diâmetro: 15 mm), perto da câmara e começar a bomba com o fluxo fixado em 140 ml / min. Quando a temperatura do circuito atinge 37 ° C, iniciar a cronometragem e, periodicamente, colher amostras para determinar quando parar a digestão. Coloração com ditizona (2 mg / ml) permite a visualização microscópica de ilhotas no tecido digerido 4. Uma vez que os ilhéus são separados a partir do tecido acinar circundante, rapidamente parar a digestão, colocando a bobina de aquecimento no gelo e adicionando 200 ml de mídia lavagem a frio (900 ml RPMI 1640 com 5,5 mM de glicose e FBS 10%) para o circuito. Recolher a solução de ilhotas em 250 ml tubos cônicos, uma vez que sai do tubo de amostra. Continue até que o circuito está vazio. Figura 1. O circuito de digestão humana pâncreas O circuito digestão humana pâncreas inclui uma câmara de Ricordi contendo mesh (diâmetro dos poros: 600 mm) e três bolas de gude nitreto de silício (diâmetro: 15 mm). Saída da câmara é movida para o balão de coleta de tecido pela bomba peristáltica (140 ml / min). Setas indicam a direção do fluxo. Uma temperatura ideal para a digestão enzimática é mantida por imersão da bobina de aquecimento em banho-maria a 37 ° C. 5. Lavagem pós-digestão Centrifugar a 250 ml tubos cônicos contendo a solução de ilhotas a 1000 rpm, 4 ° C por 5 min. Desprezar o sobrenadante, ressuspender o sedimento ilhota na lavagem de mídia (900 ml RPMI 1640 com 5,5 mM de glicose e FBS 10%) e distribuí-lo em frações iguais a 50 tubos de ml. (Opcional:. Distribuir em tubos cônicos adicionais para melhorar a lavagem) Centrifugar a 1000 rpm, 4 ° C por 5 min. Elimine o sobrenadante e gentilmente afrouxar pellets por agitação manual. 6. Purificação em um gradiente de Ficoll Ressuspender o sedimento com Ficoll media a uma densidade de 1,125 g / ml, pH 7,4 e lentamente overlay alíquotas de 10 ml de Ficoll media com densidades de 1,080, 1,060 e 1,037 g / ml. Centrifugar os gradientes de Ficoll a 2400 rpm, 4 ° C por 20 min. 7. Islet Recolha e Cultura Após a centrifugação, componentes do tecido diferentes podem ser distinguidos pela sua partição no gradiente. Descartar a camada superior composta de gordura e tecido conjuntivo. Cuidadosamente a colheita da primeira camada de agregados ilhota na interfase 1,037-1,060 g / ml. Esta camada contém as ilhotas mais puro isolado. Coletar fracções para isolamento eficiente. Recolher a fracção de segundo, menos pura de agregados ilhota na interfase 1,060-1,080 g / ml. Diluir o gradiente de Ficoll, adicionando media de lavagem (900 ml RPMI 1640 com 5,5 mM de glicose e FBS 10%) a cada tubo cônico até um volume total de 50 ml. Centrifugar a 1000 rpm, 4 ° C por 5 min. Desprezar o sobrenadante por sucção. Tenha cuidado como o pellet pode estar solto devido ao gradiente de Ficoll. Lave o wi pelletsª lavagem de mídia (900ml RPMI 1640 com 5,5 mM de glicose e FBS 10%) e centrifugar a 1000 rpm, 4 ° C por 5 min. Repita usando meios de cultura ilhéu Volte a suspender as ilhotas em meios de cultura e colocá-los na incubadora com 5% de CO 2 a 37 ° C por 24-48 horas antes do processamento.