Transduction pour étiqueter les cellules tumorales PDX : Introduction du lentivirus exprimant le marqueur fluorescent dans la cellule tumorale in vitro

1. Transduction des cellules tumorales dérivées du PDX

1. Centrifugeuse dissocié cellules tumorales à 300 g x 5 min et resuspendre dans 2 ml de médias mammosphère. Comptez les cellules viables à l’aide de l’exclusion bleue trypan (Resuspend cellules digérées dans 5 ml tampon de lavage et compter les cellules viables et non viables en utilisant trypan exclusion bleue. En bref, mélanger 50 μl de cellules et 50 μl de bleu trypan et compter trypan-bleu à l’exclusion des cellules à l’aide d’un hémocytomètre).
2. Préparer 10 ml de mammosphère contenant 8 μg/ml de polybrene (2 μl de polybrene de stock par ml de médias).
3. Déterminez le volume nécessaire pour 2 x 10^{5 cellules} tumorales viables. Cellules centrifugeuses à 300 x g pendant 5 min, et resuspendre la pastille dans 2 ml de polybrene contenant des supports. Plaque 2 x 10^{5 cellules tumorales} viables par puits dans une plaque de culture tissulaire ultra-faible de 6 puits.
   REMARQUE: Il s’agit d’un nombre optimal de cellules nécessaires à la transduction avec un vecteur lentiviral.
   ATTENTION! Les particules lentivirales et tous les consommables utilisés avec les particules lentivirales doivent être manipulés selon les procédures institutionnelles pour les biorisques d’ADN recombinants.
   REMARQUE: La transduction lentivirale des cellules mammaires primaires favorise fortement les cellules myoepitheliales qui peuvent avoir comme conséquence un mauvais étiquetage des cellules luminaires et la sélection des sous-populations des cellules de tumeur pendant l’étiquetage.
4. Incuber le virus avec 200 mU/ml de neuraminidase à 37 °C pendant 1 heure avant la transduction afin d’augmenter la liaison des particules virales à différentes sous-populations de cellules primaires et de corriger ce biais potentiel.
5. Ajouter les particules lentivirales à 10 MOI (2 x 10⁶ TU pour 2 x 10⁵ cellules viables) si les cellules dissociées par PDX sont épuisées des cellules de souris Lin+ ou enrichies en cellules EpCam+. Ajouter les particules lentivirales à 30 MOI (6 x 10⁶ TU pour 2 x 10⁵ cellules viables) si vous utilisez des cellules non enrichies dissociées pdx.
   REMARQUE: L’augmentation du MOI permet une transduction efficace même en présence de grandes quantités de débris et de cellules mortes dans des extraits bruts. Gardez-en un bien avec des cellules non étiquetées pour servir de contrôle pour la viabilité et l’efficacité de la transduction.
6. Tourbillonnez pour mélanger le virus avec les cellules. Incuber à 37 °C, 5 % de CO_{2 jusqu’à} 96 heures. Ajouter 500 μl de mammosphère fraîche 24 heures après la transfection. Les cellules ne se fixent pas aux plaques, n’aspirent pas les médias.

2. Évaluation de l’efficacité de transduction et de la réimplantation des cellules étiquetées chez les souris immunocompromisées

1. Surveillez l’expression du marqueur traçable (GFP) toutes les 24 heures à l’aide d’un microscope fluorescent au grossissement 10X.
   REMARQUE: L’expression GFP peut être observée dès 24 heures après l’infection, mais dans la plupart des PDX, l’expression GFP est clairement visible après 72 heures (figure 1).
2. Estimer l’efficacité de la transduction en évaluant le pourcentage de cellules GFP+ dans le puits total.
   REMARQUE: Puisque les cultures contiennent des cellules tumorales, des cellules stromales résiduelles et des cellules mortes à divers degrés, des puits contenant jusqu’à 10 % de cellules GFP+ peuvent être implantés dans une souris hôte.
3. Transférer les cellules transduced des plaques de 6 puits dans un tube conique de 15 ml. Ajouter 1 ml de mammosphère au puits pour recueillir toutes les cellules laissées derrière. Placer sur la glace.
4. Ajouter 10 ml de HBSS/hepes aux cellules transduites et centrifugeuses à 300 x g pendant 5 min, 4 °C. Aspirer soigneusement le supernatant et le résuspendre dans l’extrait de matrice de sous-sol de 50 μl (BME) sur la glace.
   REMARQUE: Les aliquots BME doivent être décongelés sur la glace, de 1 à 2 heures avant l’utilisation. Le BME se solidifiera à température ambiante; garder sur la glace en tout temps.
5. Chargez les cellules intégrées au BME dans une seringue à insuline de 0,5 ml, continuez sur la glace et apportez-les à l’installation animale pour la réimplantation chez les souris NSG.

Figure 1 : Suivi de l’efficacité de la transduction dans les cellules PDX dissociées. A) Cellules dissociées PDX enrichies pour les cellules épithéliales humaines (épuisement Lin+) 24 heures après transduction avec des particules lentivirales pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro. B) Cellules dissociées pdx d’une expérience distincte, sans enrichissement épithélial de cellules, 72 heures après transduction avec pHAGE-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. Les deux panneaux montrent des cellules vivantes. BF: Images de champ lumineux, la barre représente 50 μm