PDX 종양 세포를 표지하기 위하여 변환: 시험관에 있는 종양 세포로 형광 마커를 표현하는 렌즈바이러스를 소개합니다

1. PDX 유래 종양 세포의 전도

1. 원심분리기는 종양 세포를 300 g x 5분에서 해리시키고 2ml 유방스피어 미디어에서 재중단하였다. trypan 블루 제외를 사용하여 실행 가능한 셀을 계산합니다(5ml 세척 버퍼에서 소화된 세포를 재일시 중단하고 trypan blue 제외를 사용하여 실행 가능한 셀과 실행 불가능한 셀을 모두 계산합니다. 간략하게, 세포의 50 μl과 트라이판 블루의 50 μl을 혼합하고 혈류계를 사용하여 세포를 제외 트라이팬 블루를 계산합니다).
2. 8 μg/ml 폴리브레인(미디어 ml 당 2 μl 의 재고 폴리브레인)을 포함하는 매머스피어 미디어 10ml를 준비합니다.
3. 2 x 10⁵ 실행 가능한 종양 세포에 필요한 부피를 결정합니다. 원심분리기 세포는 300 x g에서 5분 동안, 미디어를 포함하는 폴리브레인 2ml에서 펠릿을 재축한다. 플레이트 2 x 10⁵ 실행 가능한 종양 세포는 6웰 초저 준수 조직 배양 플레이트에서 잘 한다.
   참고: 이것은 하나의 렌즈바이러스 벡터를 가진 transctionction에 요구되는 세포의 최적 수입니다.
   주의! 렌티바이러스 입자및 렌티바이러스 입자와 함께 사용되는 모든 소모품은 재조합 DNA 생물학적 위험에 대한 제도적 절차에 따라 처리되어야 합니다.
   참고: 1 차 유방 세포의 Lentiviral 변환은 강하게 발광 세포의 가난한 표시 및 라벨링 도중 종양 세포의 하위 집단의 선택귀착될 수 있는 근피성 세포를 선호합니다.
4. 200mU/ml 뉴라미니다아제로 바이러스를 37°C에서 37°C로 배양하여 다른 1차 세포 하위 집단으로 바이러스 입자의 결합을 증가시키고 이러한 잠재적 바이어스를 위해 정확합니다.
5. PDX 해리 세포가 Lin+ 마우스 세포에서 고갈되거나 EpCam+ 세포에서 농축되는 경우 10 MOI(2 x 10⁶ TU 2 x 10⁵ 실행 가능한 셀)에 렌티바이러스 입자를 추가합니다. 비 농축 PDX 해리 세포를 사용하는 경우 30 MOI (6 x 10⁶ TU 2 x 10⁵ 실행 가능한 세포)에 렌티 바이러스 입자를 추가합니다.
   참고: 증가된 MOI는 원유 추출물에 많은 양의 파편과 죽은 세포가 있는 경우에도 효율적인 트랜스포션을 가능하게 합니다. 라벨이 없는 셀과 잘 유지하여 생존력과 트랜스듀션 효율성을 제어할 수 있습니다.
6. 세포와 바이러스를 혼합 소용돌이. 37°C에서 배양하고, 최대 96시간 동안 5%_CO2를 배양합니다. 전환 후 24시간 신선한 맘모스피어 미디어 500 μl을 추가합니다. 세포는 접시에 부착되지 않습니다, 미디어를 흡인하지 않습니다.

2. 면역 손상된 마우스에 있는 표지된 세포의 감산 효율 및 재이식의 평가

1. 추적 가능한 마커(GFP)의 발현을 10배율로 형광 현미경을 사용하여 매 24시간마다 모니터링한다.
   참고: GFP 발현은 감염 후 24시간 일찍 관찰될 수 있지만 대부분의 PDXSGFP 발현은 72시간(도1)후에명확하게 볼 수 있다.
2. 총 우물 내에서 GFP+ 셀의 백분율을 평가하여 변환의 효율성을 추정합니다.
   참고: 배양은 종양 세포를 포함하기 때문에, 잔류 기질 세포, 및 각종 정도에서 죽은 세포, 10%의 낮은 GFP+ 세포를 가진 우물은 호스트 마우스에 이식될 수 있습니다.
3. 6웰 플레이트에서 15ml 원물 튜브로 변환된 세포를 전달합니다. 유방 스피어 미디어 1 ml를 우물에 추가하여 남은 모든 세포를 수집합니다. 얼음 위에 놓습니다.
4. 변환된 세포에 10ml의 HBSS/헤페를 넣고 300 x g에서 5분, 4°C에 원심분리기를 넣습니다. 조심스럽게 슈퍼 나위를 흡인하고 얼음에 50 μl 지하 매트릭스 추출물 (BME)에서 재중단.
   참고: BME 알리쿼트는 사용하기 전에 얼음에 1-2 시간 해동되어야 합니다. BME는 실온에서 고화됩니다. 항상 얼음을 유지합니다.
5. BME 내장 된 세포를 0.5 ml 인슐린 주사기에 적재하고 얼음을 유지하고 NSG 마우스로 재이식하기 위해 동물 시설에 가져 오십시오.

그림 1: 분리된 PDX 셀의 트랜스유도 효율 추적. A) PDX 해리 세포는 pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro 렌즈피바이러스 입자와 의 전염 후 24시간 인간 상피 세포(Lin+ 고갈)를 위해 농축된다. B) PDX-해리 된 세포는 상피 세포 농축없이, pHAGE-EF1aL-루시파제 -UBC-GFP-W와 의 전염 후 72 시간 별도의 실험에서 분리된 세포를 분리하였다. 두 패널 모두 라이브 셀을 표시합니다. BF: 밝은 필드 이미지, 바는 50 μm을 나타냅니다.