Generazione e co-coltura di microglia primarie murine e neuroni corticali
Summary
Questo protocollo descrive una co-coltura microglia-neuronale stabilita da cellule neuronali primarie isolate da embrioni di topo ai giorni embrionali 15-16 e microglia primaria generata dal cervello di topi neonatali nei giorni post-natali 1-2.
Abstract
Le microglia sono macrofagi residenti nei tessuti del sistema nervoso centrale (SNC) che svolgono numerose funzioni che supportano la salute neuronale e l’omeostasi del SNC. Sono una delle principali popolazioni di cellule immunitarie associate all’attività della malattia del SNC, adottando fenotipi reattivi che potenzialmente contribuiscono al danno neuronale durante le malattie neurodegenerative croniche come la sclerosi multipla (SM). I meccanismi distinti con cui le microglia regolano la funzione neuronale e la sopravvivenza durante la salute e la malattia rimangono limitati a causa delle sfide nella risoluzione delle complesse interazioni in vivo tra microglia, neuroni e altri fattori ambientali del SNC. Pertanto, l’approccio in vitro di co-coltura di microglia e neuroni rimane uno strumento prezioso per lo studio delle interazioni microglia-neuroni. Qui, presentiamo un protocollo per generare e co-coltivare microglia primarie e neuroni da topi. In particolare, le microglia sono state isolate dopo 9-10 giorni in vitro da una coltura gliale mista stabilita da omogenati cerebrali derivati da topi neonati tra i giorni post-natali 0-2. Le cellule neuronali sono state isolate da cortecce cerebrali di embrioni di topo tra i giorni embrionali 16-18. Dopo 4-5 giorni in vitro, le cellule neuronali sono state seminate in piastre a 96 pozzetti, seguite dall’aggiunta di microglia per formare la co-coltura. Un’attenta tempistica è fondamentale per questo protocollo, poiché entrambi i tipi di cellule devono raggiungere la maturità sperimentale per stabilire la co-coltura. Nel complesso, questa co-coltura può essere utile per studiare le interazioni microglia-neurone e può fornire più letture, tra cui la microscopia a immunofluorescenza, l’imaging dal vivo e i saggi di RNA e proteine.
Introduction
Le microglia sono macrofagi residenti nei tessuti che facilitano l’immunosorveglianza e l’omeostasi nel sistema nervoso centrale (SNC)1,2,3. Originano dalle cellule progenitrici eritromieloidi del sacco vitellino che colonizzano il cervello durante lo sviluppo embrionale 4,5,6 e vengono mantenute per tutta la durata della vita dell’organismo attraverso l’autorinnovamento, che comporta la proliferazione e l’apoptosi7. Allo stato stazionario, le microglia a riposo hanno una morfologia ramificata e si impegnano nella sorveglianza dei tessuti 8,9,10.
Le microglia esprimono numerosi recettori della superficie cellulare, che consentono loro di rispondere rapidamente ai cambiamenti nel SNC11,12 e di promuovere risposte infiammatorie in caso di infezioni o lesioni tissutali 12,13,14, nonché durante le malattie neurodegenerative 9,15, come la sclerosi multipla (SM)16,17. Le microglia esprimono anche recettori per vari neurotrasmettitori e neuropeptidi 18,19,20, il che suggerisce che possono anche rispondere e regolare l’attività neuronale 21,22. Infatti, la microglia e i neuroni interagiscono in varie forme di comunicazione bidirezionale 8,23 come le interazioni dirette mediate dalle proteine di membrana o le interazioni indirette attraverso fattori solubili o cellule intermedie23,24.
Ad esempio, vari neurotrasmettitori secreti dai neuroni possono modulare l’attività neuroprotettiva o infiammatoria della microglia 25,26,27. Inoltre, le interazioni dirette tra i neuroni e la microglia aiutano a mantenere la microglia in uno stato omeostatico28. Al contrario, le interazioni dirette della microglia con i neuroni possono modellare i circuiti neuronali29 e influenzare la segnalazione neuronale 30,31,32. Poiché le interruzioni di queste interazioni inducono ipereccitabilità dei neuroni30 e reattività della microglia33,34, le interazioni disregolate microglia-neuroni sono implicate come fattore che contribuisce alle malattie neurologiche33,35. Infatti, è stato descritto che le malattie psicotiche23,26 e neurodegenerative mostrano interazioni disfunzionali microglia-neuroni33. Sebbene queste osservazioni evidenzino l’importanza della comunicazione microglia-neuroni nel SNC, i meccanismi specifici di come queste interazioni regolano le funzioni microgliali e neuronali in salute e malattia sono relativamente sconosciuti.
All’interno di un ambiente complesso come il SNC, molteplici fattori ambientali possono influenzare le interazioni microglia-neuronali, il che limita la capacità di studiare le interazioni cellulari transitorie in vivo. Qui, presentiamo un sistema di co-coltura microglia-neuroni in vitro che può essere utilizzato per studiare le interazioni cellulari dirette tra microglia e neuroni. Questo protocollo descrive la generazione di microglia primarie e neuroni dalle cortecce di topi neonatali tra i giorni post-natali 0-2 e i giorni 16-18 dei topi embrionali, rispettivamente. I neuroni e la microglia vengono quindi co-coltivati in piastre da 96 pozzetti per esperimenti ad alto rendimento a valle. In precedenza abbiamo utilizzato questo approccio per dimostrare che la fagocitosi della microglia protegge i neuroni dalla morte cellulare mediata dalla fosfatidilcolina ossidata37, suggerendo che questo metodo può aiutare a comprendere i ruoli della microglia nel contesto della neurodegenerazione e della SM. Allo stesso modo, le co-colture microglia-neuroni possono anche essere utili per studiare l’impatto del crosstalk microglia-neuronale in altri contesti come le infezioni virali38 o il danno e la riparazione neuronale39. Nel complesso, i sistemi di co-coltura microglia-neuroni in vitro consentono ai ricercatori di studiare le interazioni microglia-neuroni in un ambiente manipolabile e controllato, che integra i modelli in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo descrive un protocollo per isolare e coltivare i neuroni primari di topo e la microglia primaria, che vengono successivamente utilizzati per stabilire una co-coltura microglia-neurone che può essere utilizzata per studiare come le interazioni tra microglia e neuroni regolano la loro salute e funzione cellulare. Questo approccio relativamente semplice e accessibile può fornire informazioni critiche sui meccanismi e sugli esiti funzionali delle interazioni dei neuroni del…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JP riconosce il sostegno finanziario del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada e del College of Medicine dell’Università del Saskatchewan. YD riconosce il sostegno finanziario del College of Medicine Startup Fund dell’Università del Saskatchewan, del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2023-03659), dell’MS Canada Catalyst Grant (1019973), del Saskatchewan Health Research Foundation Establishment Grant (6368) e del Brain Canada Foundation Future Leaders in Canadian Brain Research Grant. La Figura 1A, la Figura 2A e la Figura 3A sono state create con BioRender.com.
Materials
| 10 cm Petri dish | Fisher | 07-202-011 | Sterile |
| 1x Versene | Gibco | 15040-066 | |
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | |
| Dissection microscope | VWR | ||
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Sci | 12483-020 | |
| HBSS (10x) | Gibco | 14065-056 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| HEPES | ThermoFisher Sci | 15630080 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium (1x) | Fisher Scientific | 21083027 | |
| Macrophage colony stimulating factor | Peprotech | 315-02 | |
| Micro-Forceps | RWD | F11020-11 | Autoclaved/Sterile |
| Non-essential amino acids | Cytiva | SH3023801 | |
| PBS (10x) | ThermoFisher Sci | AM9625 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamine (100x) | Gibco | 103780-16 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma | P3655-100MG | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Spring scissors | RWD | S11008-42 | Autoclaved/Sterile |
| Surgical blade | Feather | 08-916-5D | Sterile |
| T-25 flasks | Fisher | 10-126-9 | |
| T-75 flasks | Fisher | 13-680-65 | |
| Tissue forceps | Codman | 30-4218 | Autoclaved/Sterile |
| Tissue scissors | RWD | S12052-10 | Autoclaved/Sterile |
| Trypan Blue | Thermofisher Sci | 15250-061 | |
| Trypsin (2.5%) | ThermoFisher Sci | 15090046 | |
| Widefield Immunofluorescence Microscope | Zeiss |
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