توليد وزراعة الفئران الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية والخلايا العصبية القشرية
Summary
يصف هذا البروتوكول ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية المشتركة التي تم إنشاؤها من الخلايا العصبية الأولية المعزولة من أجنة الفئران في الأيام الجنينية 15-16 والخلايا الدبقية الصغيرة الأولية المتولدة من أدمغة الفئران حديثي الولادة في أيام ما بعد الولادة 1-2.
Abstract
الخلايا الدبقية الصغيرة هي بلاعم مقيمة في الأنسجة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، تؤدي العديد من الوظائف التي تدعم صحة الخلايا العصبية وتوازن الجهاز العصبي المركزي. هم مجموعة كبيرة من الخلايا المناعية المرتبطة بنشاط مرض الجهاز العصبي المركزي ، واعتماد الأنماط الظاهرية التفاعلية التي من المحتمل أن تسهم في إصابة الخلايا العصبية أثناء الأمراض العصبية المزمنة مثل التصلب المتعدد (MS). لا تزال الآليات المتميزة التي تنظم بها الخلايا الدبقية الصغيرة وظيفة الخلايا العصبية والبقاء على قيد الحياة أثناء الصحة والمرض محدودة بسبب التحديات في حل التفاعلات المعقدة في الجسم الحي بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية والعوامل البيئية الأخرى في الجهاز العصبي المركزي. وبالتالي ، فإن النهج في المختبر للاستزراع المشترك للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية يظل أداة قيمة لدراسة التفاعلات العصبية الدبقية الصغيرة. هنا ، نقدم بروتوكولا لتوليد الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية والخلايا العصبية من الفئران والمشاركة في استزراعها. على وجه التحديد ، تم عزل الخلايا الدبقية الصغيرة بعد 9-10 أيام في المختبر من ثقافة دبقية مختلطة تم إنشاؤها من متجانسات الدماغ المشتقة من الفئران الوليدية بين أيام ما بعد الولادة 0-2. تم عزل الخلايا العصبية من القشرة الدماغية لأجنة الفئران بين الأيام الجنينية 16-18. بعد 4-5 أيام في المختبر ، تم زرع الخلايا العصبية في 96 لوحة بئر ، تليها إضافة الخلايا الدبقية الصغيرة لتشكيل الثقافة المشتركة. يعد التوقيت الدقيق أمرا بالغ الأهمية لهذا البروتوكول حيث يحتاج كلا النوعين من الخلايا إلى الوصول إلى مرحلة النضج التجريبي لإنشاء الثقافة المشتركة. بشكل عام ، يمكن أن تكون هذه الثقافة المشتركة مفيدة لدراسة تفاعلات الخلايا العصبية الدبقية الصغيرة ويمكن أن توفر قراءات متعددة ، بما في ذلك الفحص المجهري المناعي ، والتصوير الحي ، وكذلك فحوصات الحمض النووي الريبي والبروتين.
Introduction
الخلايا الدبقية الصغيرة هي بلاعم مقيمة في الأنسجة تسهل المراقبة المناعية والتوازن في الجهاز العصبي المركزي (CNS)1،2،3. وهي تنشأ من الخلايا السلفية لكيس الكريات الحمر التي تستعمر الدماغ أثناء التطور الجنيني4،5،6 ويتم الحفاظ عليها طوال فترة حياة الكائن الحي من خلال التجديد الذاتي ، والذي ينطوي على الانتشار وموت الخلايا المبرمج7. في الحالة المستقرة ، تشعبت الخلايا الدبقية الصغيرة أثناء الراحة وتشارك في مراقبة الأنسجة8،9،10.
تعبر الخلايا الدبقية الصغيرة عن العديد من مستقبلات سطح الخلية ، والتي تمكنها من الاستجابة السريعة للتغيرات في الجهاز العصبي المركزي11,12 وتعزيز الاستجابات الالتهابية في حالة حدوث عدوى أو إصابة الأنسجة 12,13,14 ، وكذلك أثناء الأمراض التنكسية العصبية 9,15 ، مثل التصلب المتعدد (MS)16,17. تعبر الخلايا الدبقية الصغيرة أيضا عن مستقبلات لمختلف الناقلات العصبية والببتيدات العصبية18،19،20 ، مما يشير إلى أنها قد تستجيب أيضا للنشاط العصبي وتنظمه21،22. في الواقع ، تتفاعل الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية في أشكال مختلفة من الاتصال ثنائي الاتجاه 8,23 مثل التفاعلات المباشرة بوساطة بروتينات الغشاء أو التفاعلات غير المباشرة من خلال العوامل القابلة للذوبان أو الخلايا الوسيطة23,24.
على سبيل المثال ، يمكن للناقلات العصبية المختلفة التي تفرزها الخلايا العصبية تعديل النشاط العصبي أو الالتهابي للخلايا الدبقية الصغيرة25،26،27. بالإضافة إلى ذلك ، تساعد التفاعلات المباشرة بين الخلايا العصبية والدبقية الصغيرة في الحفاظ على الخلايا الدبقية الصغيرة في حالة الاستتباب28. على العكس من ذلك ، يمكن للتفاعلات المباشرة للخلايا الدبقية الصغيرة مع الخلايا العصبية تشكيل الدوائر العصبية29 والتأثير على الإشارات العصبية30،31،32. نظرا لأن اضطرابات هذه التفاعلات تحفز فرط استثارة الخلايا العصبية30 وتفاعل الخلايا الدبقية الصغيرة33,34 ، فإن التفاعلات العصبية الدبقية الصغيرة غير المنظمة متورطة كعامل مساهم في الأمراض العصبية33,35. في الواقع ، تم وصف الأمراض الذهانية23,26 والأمراض التنكسية العصبية لإظهار تفاعلات الخلايا الدبقية الصغيرة المختلةوظيفيا 33. في حين أن هذه الملاحظات تسلط الضوء على أهمية التواصل بين الخلايا العصبية الدبقية الصغيرة في الجهاز العصبي المركزي ، فإن الآليات المحددة لكيفية تنظيم هذه التفاعلات للوظائف الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية في الصحة والمرض غير معروفة نسبيا.
داخل بيئة معقدة مثل الجهاز العصبي المركزي ، يمكن أن تؤثر عوامل بيئية متعددة على التفاعلات العصبية الدبقية الصغيرة ، مما يحد من القدرة على دراسة التفاعلات الخلوية العابرة في الجسم الحي. هنا ، نقدم نظام زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر والذي يمكن استخدامه لدراسة التفاعلات الخلوية المباشرة بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية. يصف هذا البروتوكول توليد الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية والخلايا العصبية من قشرة الفئران حديثي الولادة بين أيام ما بعد الولادة 0-2 وأيام الفئران الجنينية 16-18 ، على التوالي. ثم يتم استزراع الخلايا العصبية والدبقية الصغيرة في 96 لوحة بئر لإجراء تجارب عالية الإنتاجية في المصب. استخدمنا هذا النهج سابقا لإثبات أن البلعمة الدبقية الصغيرة تحمي الخلايا العصبية من موت الخلايا بوساطة الفوسفاتيديل كولينالمؤكسد 37 ، مما يشير إلى أن هذه الطريقة يمكن أن تساعد في فهم أدوار الخلايا الدبقية الصغيرة في سياق التنكس العصبي والتصلب العصبي المتعدد. وبالمثل ، قد تكون الثقافات المشتركة للخلايا الدبقية الصغيرة مفيدة أيضا للتحقيق في تأثير الحديث المتبادل بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية في سياقات أخرى مثل الالتهابات الفيروسية38 أو إصابة الخلايا العصبية وإصلاحها39. بشكل عام ، تمكن أنظمة الزراعة المشتركة للخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر الباحثين من دراسة التفاعلات العصبية الدبقية الصغيرة في بيئة قابلة للتلاعب والتحكم ، والتي تكمل النماذج في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه المقالة بروتوكولا لعزل وزراعة الخلايا العصبية الأولية للفأر والدبقية الصغيرة الأولية ، والتي تستخدم لاحقا لإنشاء ثقافة مشتركة بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية يمكن استخدامها لدراسة كيفية تنظيم تفاعلات الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية لصحتها الخلوية ووظي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر JP بدعم التمويل من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا وكلية الطب بجامعة ساسكاتشوان. تقر YD بدعم التمويل المقدم من صندوق بدء التشغيل لكلية الطب بجامعة ساسكاتشوان ، ومنحة اكتشاف مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (RGPIN-2023-03659) ، ومنحة MS Canada Catalyst (1019973) ، ومنحة مؤسسة ساسكاتشوان للبحوث الصحية (6368) ، ومنحة قادة المستقبل لمؤسسة Brain Canada في منحة أبحاث الدماغ الكندية. تم إنشاء الشكل 1 أ والشكل 2 أ والشكل 3 أ باستخدام BioRender.com.
Materials
| 10 cm Petri dish | Fisher | 07-202-011 | Sterile |
| 1x Versene | Gibco | 15040-066 | |
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | |
| Dissection microscope | VWR | ||
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Sci | 12483-020 | |
| HBSS (10x) | Gibco | 14065-056 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| HEPES | ThermoFisher Sci | 15630080 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium (1x) | Fisher Scientific | 21083027 | |
| Macrophage colony stimulating factor | Peprotech | 315-02 | |
| Micro-Forceps | RWD | F11020-11 | Autoclaved/Sterile |
| Non-essential amino acids | Cytiva | SH3023801 | |
| PBS (10x) | ThermoFisher Sci | AM9625 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamine (100x) | Gibco | 103780-16 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma | P3655-100MG | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Spring scissors | RWD | S11008-42 | Autoclaved/Sterile |
| Surgical blade | Feather | 08-916-5D | Sterile |
| T-25 flasks | Fisher | 10-126-9 | |
| T-75 flasks | Fisher | 13-680-65 | |
| Tissue forceps | Codman | 30-4218 | Autoclaved/Sterile |
| Tissue scissors | RWD | S12052-10 | Autoclaved/Sterile |
| Trypan Blue | Thermofisher Sci | 15250-061 | |
| Trypsin (2.5%) | ThermoFisher Sci | 15090046 | |
| Widefield Immunofluorescence Microscope | Zeiss |
References
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. J Immunol Res. 2017, 1-12 (2017).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
- Ginhoux, F., Prinz, M. Origin of microglia: Current concepts and past controversies. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (8), a020537 (2015).
- Dermitzakis, I., et al. Origin and emergence of microglia in the CNS-an interesting (hi)story of an eccentric cell. Curr Issues Mol Biol. 45 (3), 2609-2628 (2023).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Askew, K., et al. Coupled proliferation and apoptosis maintain the rapid turnover of microglia in the adult brain. Cell Rep. 18 (2), 391-405 (2017).
- Vidal-Itriago, A., et al. Microglia morphophysiological diversity and its implications for the CNS. Front Immunol. 13, 997786 (2022).
- Wendimu, M. Y., Hooks, S. B. Microglia phenotypes in aging and neurodegenerative diseases. Cells. 11 (13), 2091 (2022).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: Active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
- Zhao, J. F., et al. Research progress on the role of microglia membrane proteins or receptors in neuroinflammation and degeneration. Front Cell Neurosci. 16, 831977 (2022).
- Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The role of microglia in central nervous system immunity and glioma immunology. J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).
- Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198 (2020).
- Doens, D., Fernández, P. L. Microglia receptors and their implications in the response to amyloid β for Alzheimer’s disease pathogenesis. J Neuroinflammation. 11 (1), 48 (2014).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: Uncovering the molecular mechanisms. Nat Rev Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
- Fischer, M. T., et al. NADPH oxidase expression in active multiple sclerosis lesions in relation to oxidative tissue damage and mitochondrial injury. Brain. 135 (3), 886-899 (2012).
- Marinelli, S., Basilico, B., Marrone, M. C., Ragozzino, D. Microglia-neuron crosstalk: Signaling mechanism and control of synaptic transmission. Semin Cell Dev Biol. 94, 138-151 (2019).
- Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
- Carniglia, L., et al. Neuropeptides and microglial activation in inflammation, pain, and neurodegenerative diseases. Mediators Inflamm. 2017, 5048616 (2017).
- Zhao, S., Umpierre, A. D., Wu, L. J. Tuning neural circuits and behaviors by microglia in the adult brain. Trends Neurosci. 47 (3), 181-194 (2024).
- Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: New roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
- Haidar, M. A., et al. Crosstalk between microglia and neurons in neurotrauma: An overview of the underlying mechanisms. Curr Neuropharmacol. 20 (11), 2050-2065 (2022).
- Cserép, C., Pósfai, B., Dénes, &. #. 1. 9. 3. ;. Shaping neuronal fate: Functional heterogeneity of direct microglia-neuron interactions. Neuron. 109 (2), 222-240 (2021).
- Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
- Eyo, U. B., Wu, L. J. Bidirectional microglia-neuron communication in the healthy brain. Neural Plast. 2013, 456857 (2013).
- Strosznajder, J. B., Czapski, G. A. Glutamate and GABA in microglia-neuron cross-talk in Alzheimer’s disease. Int J Mol Sci. 22 (21), 11677 (2021).
- Lyons, A., et al. CD200 ligand-receptor interaction modulates microglial activation in vivo and in vitro A role for IL-4. J Neurosci. 27 (31), 8309-8313 (2007).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: Actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends Neurosci. 36 (4), 209-217 (2013).
- Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nat Neurosci. 24 (1), 19-23 (2021).
- Chen, Z., et al. Microglial displacement of inhibitory synapses provides neuroprotection in the adult brain. Nat Commun. 5 (1), 4486 (2014).
- Cantaut-Belarif, Y., et al. Microglia control the glycinergic but not the GABAergic synapses via prostaglandin E2 in the spinal cord. J Cell Biol. 216 (9), 2979-2989 (2017).
- Szepesi, Z., Manouchehrian, O., Bachiller, S., Deierborg, T. Bidirectional microglia-neuron communication in health and disease. Front Cell Neurosci. 12, 323 (2018).
- Chamera, K., Trojan, E., Szuster-Głuszczak, M., Basta-Kaim, A. The potential role of dysfunctions in neuron-microglia communication in the pathogenesis of brain disorders. Curr Neuropharmacol. 18 (5), 408-430 (2020).
- Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: Mechanism and potential therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 359 (2023).
- Brisch, R., et al. The role of microglia in neuropsychiatric disorders and suicide. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 272 (6), 929-945 (2022).
- Dong, Y., et al. Oxidized phosphatidylcholines found in multiple sclerosis lesions mediate neurodegeneration and are neutralized by microglia. Nat Neurosci. 24 (4), 489-503 (2021).
- Alvarez-Carbonell, D., et al. Cross-talk between microglia and neurons regulates HIV latency. PLoS Pathog. 15 (12), e1008249 (2019).
- Lorenzen, K., et al. Microglia induce neurogenic protein expression in primary cortical cells by stimulating PI3K/AKT intracellular signaling in vitro. Mol Biol Rep. 48 (1), 563-584 (2021).
- Güler, B. E., Krzysko, J., Wolfrum, U. Isolation and culturing of primary mouse astrocytes for the analysis of focal adhesion dynamics. STAR Protoc. 2 (4), 100954 (2021).
- Tomassoni-Ardori, F., Hong, Z., Fulgenzi, G., Tessarollo, L. Generation of functional mouse hippocampal neurons. Bio Protoc. 10 (15), e3702 (2020).
- Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 2 (Unit 2.7), (2006).
- Roqué, P. J., Costa, L. G. Co-culture of neurons and microglia. Curr Protoc Toxicol. 74, 11.24.1-11.24.17 (2017).
- Goshi, N., Morgan, R. K., Lein, P. J., Seker, E. A primary neural cell culture model to study neuron, astrocyte, and microglia interactions in neuroinflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 155 (2020).
- Carroll, J. A., Foliaki, S. T., Haigh, C. L. A 3D cell culture approach for studying neuroinflammation. J Neurosci Methods. 358, 109201 (2021).
- Baxter, P. S., et al. Microglial identity and inflammatory responses are controlled by the combined effects of neurons and astrocytes. Cell Rep. 34 (12), 108882 (2021).
- Luchena, C., et al. A neuron, microglia, and astrocyte triple co-culture model to study Alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 844534 (2022).
- Park, J., et al. A 3D human triculture system modeling neurodegeneration and neuroinflammation in Alzheimer’s disease. Nat Neurosci. 21 (7), 941-951 (2018).
- Vahsen, B. F., et al. Human iPSC co-culture model to investigate the interaction between microglia and motor neurons. Sci Rep. 12 (1), 12606 (2022).
- Giacomelli, E., et al. Human stem cell models of neurodegeneration: from basic science of amyotrophic lateral sclerosis to clinical translation. Cell Stem Cell. 29 (1), 11-35 (2022).
- Yong, V. W. Microglia in multiple sclerosis: protectors turn destroyers. Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).
- Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: relationship to neurodegeneration and therapeutics. J Neuroinflammation. 19 (1), 45 (2022).
- Dong, Y., Lozinski, B. M., Silva, C., Yong, V. W. Studying the microglia response to oxidized phosphatidylcholine in primary mouse neuron culture and mouse spinal cord. STAR Protoc. 2 (4), 100853 (2021).
- Anderson, S. R., et al. Neuronal apoptosis drives remodeling states of microglia and shifts in survival pathway dependence. eLife. 11, e76564 (2022).
- Harry, G. J., McPherson, C. A. Microglia: Neuroprotective and neurodestructive properties. Handbook of Neurotoxicity. , 109-132 (2014).
.