Beoordeling van de reparatieactiviteit van DNA-dubbelstrengsbreuken met behulp van high-throughput en kwantitatieve luminescentie-gebaseerde reporter-assays
Summary
We presenteren protocollen voor de beoordeling van de vaardigheid van de dubbelstrengsbreukherstelroute in cellen met behulp van een reeks op luminescentie gebaseerde extrachromosomale reportersubstraten.
Abstract
Het herstel van DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB’s) is cruciaal voor het behoud van de stabiliteit van het genoom en de levensvatbaarheid van de cel. DSB-reparatie (DSBR) in cellen wordt gemedieerd via verschillende mechanismen: homologe recombinatie (HR), niet-homologe eindverbinding (NHEJ), microhomologie-gemedieerde eindverbinding (MMEJ) en enkelstrengs gloeien (SSA). Cellulaire assays zijn essentieel om de vaardigheid en modulatie van deze routes te meten als reactie op verschillende stimuli.
Hier presenteren we een reeks extrachromosomale reporter-assays die elk de reconstitutie van een nanoluciferase-reporter-gen meten door een van de vier belangrijkste DSBR-routes in cellen. Bij voorbijgaande transfectie in cellen van belang, kan reparatie van pathway-specifieke reportersubstraten in minder dan 24 uur worden gemeten door de detectie van Nanoluciferase (NanoLuc) luminescentie.
Deze robuuste testen zijn kwantitatief, gevoelig, titreerbaar en vatbaar voor een high-throughput screeningformaat. Deze eigenschappen bieden brede toepassingen in DNA-reparatieonderzoek en het ontdekken van geneesmiddelen, als aanvulling op de momenteel beschikbare toolkit van cellulaire DSBR-assays.
Introduction
DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB’s) vertegenwoordigen een bijzonder toxische klasse van DNA-schade1 waardoor cellen meerdere DSB-reparatieroutes (DSBR) hebben ontwikkeld om deze laesies te repareren. De vier belangrijkste DSBR-mechanismen zijn homologe recombinatie (HR), niet-homologe eindverbinding (NHEJ), microhomologie-gemedieerde eindverbinding (MMEJ) en enkelstrengs gloeien (SSA)2,3. DSBR-routes dragen bij aan het behoud van de ontwikkeling en fysiologie van gezond weefsel en beschermen tegen ziekten zoals kanker. Bovendien hebben deze reparatiemechanismen therapeutisch potentieel voor de ontwikkeling van modulatoren van kleine moleculen in de precisie-oncologie. Bijvoorbeeld, het richten op DNA-polymerase θ (Polθ), een cruciaal enzym in de MMEJ-reparatieroute, heeft interesse gewekt vanwege zijn synthetische letaliteit met HR-deficiëntie bij kanker4.
Het begrijpen van DSBR heeft daarom brede klinische implicaties en functionele cellulaire assays die in staat zijn om de activiteit van alle belangrijke DSBR-routes te meten, zijn nodig5. Assays moeten geschikt zijn voor zowel genetische als farmacologische ondervraging en inzetbaar zijn in verschillende celmodellen die van belang zijn. Om de inspanningen op het gebied van de ontdekking van geneesmiddelen met kleine moleculen te ondersteunen, moeten assays zeer gevoelig en titreerbaar zijn, een snelle doorlooptijd hebben en schaalbaar zijn naar high-throughput-formaten die geschikt zijn voor het screenen van verbindingen.
Over het algemeen is DSBR eerder gemeten met behulp van op fluorescentie gebaseerde reporter-assaysystemen die stabiel in het celgenoomzijn geïntegreerd 6. Hoewel fysiologische recapitulatie van chromosomale DSBR een duidelijk voordeel is, zijn dergelijke analyses beperkt tot een gastheermodel waarin de verslaggever is geïntegreerd, maken ze gebruik van arbeidsintensieve monstervoorbereiding en -analyse door middel van flowcytometrie en hebben ze een beperkte doorvoer, doorlooptijd, robuustheid en gevoeligheid, allemaal essentiële kenmerken die nodig zijn voor inspanningen om geneesmiddelen te ontdekken.
Hier beschrijven we een reeks DSBR-reportertests die beoordeling van de vier belangrijkste DSBR-routes mogelijk maken. De reeks reporter-assaysubstraten wordt geschetst in figuur 1 en verder beschreven in een recente publicatie7. Ze zijn extrachromosoom, waardoor ze in cellen kunnen worden geïntroduceerd door eenvoudige voorbijgaande transfectie, en de opname van een nanoluciferase-reporter-gen8, dat moet worden gereconstitueerd door betrokkenheid bij specifieke DSBR-mechanismen, zorgt voor gevoeligheid, robuustheid en schaalbaarheid. De volgende DSBR reporter substraatvarianten zijn opgenomen in het protocol (Figuur 1):
Resectie-onafhankelijke MMEJ: Dit lineaire substraat bestaat uit een dubbelstrengs DNA-kerngebied (dsDNA) met enkelstrengs DNA (ssDNA) overhangen, die gereseceerde DNA-uiteinden nabootsen9. Vier nucleotide-microhomologieën aan de uiteinden van de ssDNA-regio’s coderen voor het startcodon voor het reporter-gen. Reparatie van dit substraat door middel van MMEJ herstelt het open leesraam van het reportergen (ORF).
Resectie-afhankelijke MMEJ: Het N-terminale reporter-gen exon wordt onderbroken door een segment met een stopcodon, dat wordt geflankeerd door 8 basenpaar (bp) microhomologieën. Nucleolytische eindresectie is vereist voorafgaand aan MMEJ-gemedieerd herstel om het intacte reporter-gen te herstellen.
Botte NHEJ: Het reporter-gen is opgesplitst in N- en C-terminale secties, waarvan de laatste stroomopwaarts van de promotor wordt geplaatst. De DSB wordt geproduceerd met behulp van EcoRV en vereist directe ligatie (zonder eindverwerking) door NHEJ om beide delen van het reportergen opnieuw te verbinden en de reporter ORF te herstellen.
Niet-botte NHEJ: De DSB bevindt zich in een intron en zal cohesieve of niet-cohesieve uiteinden hebben, afhankelijk van de keuze van het restrictie-enzym. De reparatie van dit substraat door NHEJ vereist ligatie die wordt voorafgegaan door eindverwerking.
Lange sjabloon HR: Het N-terminale exon van het reporter-gen wordt onderbroken door een DNA-segment dat restrictieplaatsen bevat, die 22 bp van de oorspronkelijke reporter-gensequentie vervangen. Om deze sequentie te herstellen, maakt reparatie door HR gebruik van het homologiesjabloon van 2,5 kilobase (kb) dat stroomafwaarts van het C-terminale exon is geplaatst.
Kort sjabloon HR: De beperkingsplaats die nodig is om de DSB te genereren, vervangt een deel van de oorspronkelijke reporter-gensequentie en introduceert een in-frame stopcodon. Net als de versie met lange sjablonen, vereist dit HR-substraat de stroomafwaartse homologiesjabloon (360 bp) voor nauwkeurige reparatie en restauratie van de reporter ORF.
SSA: Dit substraat bevat een voortijdig stopcodon dat zich in het N-terminale exon van het reporter-gen bevindt. De verwijdering van dit stopcodon en het herstel van de intacte reporter-gensequentie vereist reparatie door SSA, wat bidirectionele resectie op lange afstand inhoudt voorafgaand aan de uitlijning van de homologieën.
Voor het genereren van de DSB kan een deel van de reportersubstraten worden vergist met I-SceI (Figuur 1). Dit genereert een lineair substraat met niet-samenhangende uiteinden in de resectie-afhankelijke MMEJ, niet-botte NHEJ, lange sjabloon HR- en SSA-reporters, die tandem I-Sce I-sitesin omgekeerde oriëntaties hebben. In het korte sjabloon HR-reportersubstraat zal de vergisting van de enkele I-Sce I-sitesamenhangende uiteinden genereren. De niet-botte NHEJ, resectie-afhankelijke MMEJ, lange sjabloon HR en SSA-plasmiden kunnen ook worden verteerd met HindIII, dat complementaire cohesieve uiteinden zal produceren.
We bieden protocollen voor het genereren van de reporter-assaysubstraten en beschrijven hoe de assays kunnen worden uitgevoerd, waarbij we details geven over hoe ze kunnen worden gebruikt om DSBR te kwantificeren, inclusief titreerbare reacties op kleine moleculen, het beoordelen van cellulaire potentie, activiteit op het doel en pathway-selectiviteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier hebben we protocollen beschreven voor het genereren en implementeren van een reeks extrachromosomale luminescentie-gebaseerde reporters voor het meten van de cellulaire vaardigheid van de vier belangrijkste DSBR-routes (HR, NHEJ, MMEJ en SSA)7. Reportersubstraten kunnen in cellen worden geïntroduceerd door voorbijgaande transfectie en worden gebruikt om DSBR-activiteit te beoordelen met behulp van een gevoelige en robuuste plaatgebaseerde uitlezing van NanoLuc-luminescentie, die wordt gereconstitueerd bij betrokkenheid bij betrokkenheid bij verwante cellulaire DSBR-routes.
Verschillende stadia van het genereren van reporter-substraten, transfectie van de substraten in cellen en gegevensinterpretatie zijn van cruciaal belang voor de succesvolle uitvoering van deze tests. Hoewel standaard moleculair-biologische technieken worden gebruikt om de reportersubstraten te genereren, zorgt het visualiseren van het proces door middel van gelelektroforese voor de hoogste kwaliteit en zuiverheid van de substraten voorafgaand aan transfectie. Aangezien deze tests afhankelijk zijn van voorbijgaande transfectie, zijn gemeenschappelijke overwegingen voor deze methoden van toepassing. Deze omvatten het optimaliseren van de zaaidichtheid, transfectiecondities (inclusief reagentia en DNA-hoeveelheden) en het beoordelen van de geschiktheid in voorwaartse en achterwaartse transfectieformaten. Deze reporter-assays zijn met succes uitgevoerd met een reeks elektroporatie- en lipofectieprotocollen, en de opties moeten volledig worden onderzocht voordat deze tests worden uitgevoerd. Er moet ook voor worden gezorgd dat de componentsignalen NanoLuc en Firefly worden geïnspecteerd in plaats van alleen het samengestelde reparatiesignaal dat wordt afgeleid door het NanoLuc-signaal (reportersubstraat) te normaliseren naar het Firefly-signaal (controle). Artefacten kunnen ontstaan doordat de verhouding wordt bepaald door veranderingen in het Firefly-signaal. Bijvoorbeeld, het beoordelen van remming in dosis-responsmodus met behulp van een zeer specifieke verbinding zou het NanoLuc-signaal op een titreerbare manier moeten onderdrukken zonder het Firefly-signaal te verstoren, dat stabiel zou moeten blijven (Figuur 4G,H). In gevallen waarin Firefly-signalen worden verstoord, kunnen nuttige effecten op reparatie echter nog steeds worden bepaald door een dosisvenster te identificeren waarin het Firefly-signaal niet wordt beïnvloed (Figuur 5).
Vergeleken met de meest gebruikte DSBR-reporter-assays, hebben deze extrachromosomale luminescentie-gebaseerde reporter-assays enkele duidelijke voordelen. Aangezien DSBR-routes sterk geconserveerd zijn, zelfs als de cellulaire machinerie varieert tussen celmodellen, kunnen de assays nog steeds rapporteren over DSBR-vaardigheid en routekeuze. Dit stelt de beoordeling van DSBR open voor elk model dat van belang is voor de gebruiker, zolang er van tevoren optimale transiënte transfectievoorwaarden worden vastgesteld.
Het gebruik van nanoluciferase als het reporter-gen biedt ook voordelen ten opzichte van fluorescerende opties, die traditioneel zijn gebruikt in DSBR-reporter-assays. NanoLuc is snel aan het rijpen en luminescentie wordt met hoge gevoeligheid gedetecteerd met behulp van een plaatlezer8. In combinatie met de snelheid van substraatreparatie (aangezien de reportersubstraten worden getransfecteerd in cellen met kant-en-klare DSB-uiteinden), is dit formaat van DSBR-reporter-assay ideaal voor de snelle doorlooptijd en kwantitatieve robuustheid die nodig is voor het screenen van kleine moleculen als onderdeel van een industriële cascade voor het ontdekken van geneesmiddelen. Inderdaad, we hebben onlangs de implementatie beschreven van de resectie-onafhankelijke MMEJ-reporter-assay in de ontdekkingscascade die wordt gebruikt voor de identificatie van kleine molecuulremmers van het Polθ-polymerasedomein13.
Er is ook flexibiliteit in de implementatie van de reporter-assays om specifieke vragen over genetische en farmacologische verstoringen van DSBR te beantwoorden (Figuur 3). Voorafgaand aan de transfectie van de reportersubstraten kunnen cellen bijvoorbeeld gedurende 48-72 uur worden getransfecteerd met siRNA tegen een gen van belang. Als alternatief kunnen de effecten van genoverexpressie op DSBR-routes worden getest door 24-48 uur voorafgaand aan de transfectie van reportersubstraten plasmidetransfectie uit te voeren. Voor farmacologische studies beschrijft het huidige protocol al hoe het gebruik van kleine moleculen kan worden opgenomen in de standaardworkflow, maar alternatieve formaten kunnen wijzigingen in samengestelde behandelingsregimes omvatten, zoals pre-incubaties of uitspoelingen.
De schaalbaarheid van transiënte transfectie zou ook grootschalige screeningsbenaderingen kunnen ondersteunen waarbij batchtransfectie van reportersubstraten wordt uitgevoerd voorafgaand aan de screening. Bovendien kan ook de duur van de test van transfectie tot uitlezing worden gevarieerd. Hoewel de standaardduur 16-24 uur kan zijn, kunnen sommige tests in slechts6 uur 7 worden uitgelezen. Bij het bepalen van de testduur moet ook rekening worden gehouden met bezorgdheid over toxiciteit van kleine moleculen of siRNA die de levensvatbaarheid van de cel in gevaar kunnen brengen.
Samenvattend bieden de tests die in deze studie worden beschreven en volledig worden beschreven in een recente publicatie7 een snelle en robuuste beoordeling van cellulaire DSBR-vaardigheid. Ze zijn zeer gevoelig en titreerbaar, waardoor ze vatbaar zijn voor zowel genetische als farmacologische studies. Cruciaal is dat, aangezien de reportersubstraten in cellen kunnen worden geïntroduceerd door voorbijgaande transfectie, ze het potentieel hebben om te worden gebruikt in elk transfecteerbaar celmodel van belang, in plaats van beperkt te zijn tot specifieke cellijnen door stabiele integratie zoals het geval is met chromosomale DSBR-reporters. Een duidelijke beperking van deze extrachromosomale tests van reporters is echter dat het gebrek aan integratie in het genoom de fysiologische, gechromatineerde context van DNA-herstel en de bijbehorende regulerende signalen en orkestratie mogelijk niet volledig recapituleert15. Daartoe zijn extrachromosomale reporter-assays een aanvulling op bestaande methoden voor DSBR-beoordeling en breiden ze de toolkit van middelen uit die geschikt zijn voor zowel fundamenteel onderzoek als de ontdekking van geneesmiddelen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Al het werk werd gefinancierd door Artios Pharma Ltd. Figuur 1 en Figuur 3 zijn gemaakt met Biorender.com.
Materials
| 10x TBE buffer | Thermo Fisher | AM9863 | |
| 20% TBE-acrylamide gel | Invitrogen | EC6315BOX | |
| 50x TAE buffer | Fisher Scientific | BP13321 | |
| 6x Gel Loading Dye, Purple | NEB | B7024S | |
| 96-well white plate (with transparent bottom and lid) | Porvair | 204012 | |
| Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | For bead-based purification of DNA |
| Antarctic phosphatase and 10X buffer | NEB | M0289L | |
| CLARIOstar | BMG Labtech | 430-101 | Plate reader |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Cell counter |
| Custom oligonucleotides | Sigma-Aldrich | Custom order | For resection-independent MMEJ substrate. See Table 2. |
| D300e | Tecan | 30100152 | DMSO-based compound dispenser |
| D300e D4+ cassette | Tecan | 30097371 | High volume cassette for D300e compound dispenser |
| D300e T8+ cassette | Tecan | 30097370 | Low volume cassette for D300e compound dispenser |
| Dimethyl sulfoxide, cell culture grade | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Vehicle for compounds, used in Figure 4 and Figure 5 |
| DSBR reporter source plasmids | Artios | Available to the academic community upon request | |
| EcoRV-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3195M | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.365 | |
| Foetal Bovine Serum | PAN-Biotech | P30-3031 | |
| GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder | Thermo Fisher | SM1211 | Low molecular weight DNA ladder |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | Example cell line used in protocol |
| HindIII-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3104M | |
| HyClone Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | 10275262 | |
| I-SceI and 10x Tango Buffer | Invitrogen | ER1771 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.33 | |
| JetPRIME reagent and buffer | PolyPlus | 114-15 | Lipid-based transfection reagent |
| MegaStar 1.6 | VWR | 521-1749 | Centrifuge for 15 or 50 mL tubes |
| MEM Eagle | PAN-Biotech | P04-08056 | Culture medium for HEK-293 cells |
| Microplate shaker | Fisherbrand | 15504070 | Microplate orbital shaker |
| MicroStar 17R | VWR | 521-1647 | Centrifuge for 1.5 or 2 mL tubes |
| MultiDrop | Thermo Fisher | 5840300 | Cell or water-based reagent dispenser |
| MultiDrop Standard Cassette | Thermo Fisher | 24072670 | Cassette for MultiDrop reagent dispenser |
| NanoDLR Stop & Glo Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Reporter luciferase (NanoLuc) reagent to quench Firefly luminescence and detect NanoLuc luminescence. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
| ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Control luciferase (Firefly) assay reagent to detect Firefly. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
| PBS (without calcium or magnesium) | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| pGL4 Firefly plasmid (or similar) | Promega | E1310 (or equivalent) | Firefly control plasmid |
| pNL1.1 NanoLuc plasmid (or similar) | Promega | N1091 (or equivalent) | NanoLuc control plasmid, for adjustment of equipment settings/optimisation experiments |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| Quick-Load Purple 1 kb DNA Ladder | NEB | N0552S | High molecular weight DNA ladder |
| Sodium Acetate (3 M), pH 5.5 | Thermo Fisher | AM9740 | For pH adjustment during gel extraction with QIAquick Gel Extraction Kit |
| SYBR Gold (10,000x) | Invitrogen | S11494 | For visualisation of ssDNA and dsDNA |
| SYBR Safe (10,000x) | Invitrogen | S33102 | For visualisation of dsDNA only |
| T4 DNA Ligase and 10x Ligase buffer | NEB | M0202L | |
| Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | For measurement of viability during cell counting |
| Trypsin-EDTA solution; 0.25% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| XhoI and 10x CutSmart buffer | NEB | R0146M |
References
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).
- Ramsden, D. A., Carvajal-Garcia, J., Gupta, G. P. Mechanism, cellular functions and cancer roles of polymerase-theta-mediated DNA end joining. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 125-140 (2022).
- Ceccaldi, R., et al. Homologous-recombination-deficient tumours are dependent on Polθ-mediated repair. Nature. 518 (7538), 258-262 (2015).
- Bvan de Kooij, B., van Attikum, H. Genomic reporter constructs to monitor pathway-specific repair of DNA double-strand breaks. Front Genet. 12, 809832 (2021).
- Gunn, A., Stark, J. M. I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks. Methods Mol Biol. 920 (9), 379-391 (2012).
- Rajendra, E., et al. Quantitative, titratable and high-throughput reporter assays to measure DNA double strand break repair activity in cells. Nucleic Acids Res. 52 (4), 1736-1752 (2024).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- Wyatt, D. W., et al. Essential roles for polymerase θ-mediated end joining in the repair of chromosome breaks. Mol Cell. 63 (4), 662-673 (2016).
- Wood, R. D., Doublié, S. Genome protection by DNA polymerase θ. Annu Rev Genet. 56, 207-228 (2022).
- Belan, O., et al. POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells. Mol Cell. 82 (24), 4664-4680.e9 (2022).
- Zatreanu, D., et al. Polθ inhibitors elicit BRCA-gene synthetic lethality and target PARP inhibitor resistance. Nat Commun. 12 (1), 3636 (2021).
- Stockley, M. L., et al. Discovery, characterization, and structure-based optimization of small-molecule in vitro and in vivo probes for human DNA polymerase theta. J Med Chem. 65 (20), 13879-13891 (2022).
- Scott, D. E., et al. A small-molecule inhibitor of the BRCA2-RAD51 interaction modulates RAD51 assembly and potentiates DNA damage-induced cell death. Cell Chem Biol. 28 (6), 835-847.e5 (2021).
- Schep, R., et al. Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance. Mol Cell. 81 (10), 2216-2230.e10 (2021).
.