تقييم نشاط إصلاح كسر الحمض النووي المزدوج باستخدام فحوصات المراسلين عالية الإنتاجية والكمية القائمة على التلألؤ
Summary
نقدم بروتوكولات لتقييم كفاءة مسار إصلاح كسر الشريط المزدوج في الخلايا باستخدام مجموعة من ركائز مراسل خارج الكروموسومات القائمة على التلألؤ.
Abstract
يعد إصلاح فواصل الحمض النووي المزدوج (DSBs) أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على استقرار الجينوم وصلاحية الخلية. يتم التوسط في إصلاح DSB (DSBR) في الخلايا من خلال عدة آليات: إعادة التركيب المتماثل (HR) ، والانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) ، والانضمام النهائي بوساطة التماثل الدقيق (MMEJ) ، والتلدين أحادي الشريط (SSA). المقايسات الخلوية ضرورية لقياس كفاءة وتعديل هذه المسارات استجابة للمحفزات المختلفة.
هنا ، نقدم مجموعة من فحوصات المراسل خارج الكروموسومات التي يقيس كل منها إعادة تكوين جين مراسل نانولوسيفيراز بواسطة أحد مسارات DSBR الرئيسية الأربعة في الخلايا. عند الانتقال العابر إلى الخلايا ذات الأهمية ، يمكن قياس إصلاح ركائز المراسل الخاصة بالمسار في أقل من 24 ساعة عن طريق الكشف عن تلألؤ نانولوسيفيراز (NanoLuc).
هذه المقايسات القوية كمية وحساسة وقابلة للمعايرة وقابلة للفحص بتنسيق فحص عالي الإنتاجية. توفر هذه الخصائص تطبيقات واسعة في أبحاث إصلاح الحمض النووي واكتشاف الأدوية ، مكملة لمجموعة الأدوات المتاحة حاليا لمقايسات DSBR الخلوية.
Introduction
تمثل فواصل الحمض النووي المزدوجة (DSBs) فئة سامة بشكل خاص من تلف الحمض النووي1 بسبب الخلايا التي طورت مسارات متعددة لإصلاح DSB (DSBR) لإصلاح هذه الآفات. آليات DSBR الرئيسية الأربعة هي إعادة التركيب المتماثل (HR) ، والانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) ، والانضمام النهائي بوساطة التماثل الدقيق (MMEJ) ، والتلدين أحادي الشريط (SSA) 2,3. تساهم مسارات DSBR في الحفاظ على نمو الأنسجة السليمة وعلم وظائف الأعضاء والحماية من أمراض مثل السرطان. علاوة على ذلك ، فإن آليات الإصلاح هذه تحمل إمكانات علاجية لتطوير معدلات الجزيئات الصغيرة في علم الأورام الدقيق. على سبيل المثال ، جذب استهداف DNA Polymerase θ (Polθ) ، وهو إنزيم محوري في مسار إصلاح MMEJ ، الاهتمام بسبب فتكه الاصطناعي مع نقص الموارد البشرية في السرطان4.
وبالتالي ، فإن فهم DSBR له آثار سريرية واسعة ، وهناك حاجة إلى فحوصات خلوية وظيفية قادرة على قياس نشاط جميع مسارات DSBR الرئيسية5. يجب أن تكون المقايسات مناسبة لكل من الاستجواب الجيني والدوائي ويمكن نشرها عبر نماذج الخلايا ذات الأهمية. لدعم جهود اكتشاف الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة ، يجب أن تكون المقايسات حساسة للغاية ، وقابلة للمعايرة ، ولها تحول سريع ، وأن تكون قابلة للتطوير إلى تنسيقات عالية الإنتاجية مناسبة للفحص المركب.
بشكل عام ، تم قياس DSBR سابقا باستخدام أنظمة فحص المراسل القائمة على التألق المدمجة بثبات في جينوم الخلية6. ومع ذلك ، في حين أن التلخيص الفسيولوجي ل DSBR الكروموسومي هو ميزة واضحة ، فإن مثل المقايسات تقتصر على نموذج مضيف يتم فيه دمج المراسل ، ويستخدم إعداد العينات كثيفة العمالة وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي ، ولها إنتاجية محدودة ، ووقت الاستجابة ، والمتانة ، والحساسية ، وجميع الميزات الأساسية اللازمة لجهود اكتشاف الأدوية.
نصف هنا مجموعة من فحوصات مراسل DSBR التي تسمح بتقييم مسارات DSBR الرئيسية الأربعة. تم توضيح مجموعة ركائز فحص المراسل في الشكل 1 وتم وصفها بمزيد من التفصيل في منشور حديث7. إنها خارج الكروموسومات ، مما يسمح بإدخالها إلى الخلايا عن طريق النقل العابر البسيط ، ودمج جين مراسل نانولوسيفيراز8 ، والذي يجب إعادة تشكيله من خلال المشاركة مع آليات DSBR محددة ، يولد الحساسية والمتانة وقابلية التوسع. يتم تضمين متغيرات الركيزة التالية لمراسل DSBR في البروتوكول (الشكل 1):
MMEJ مستقل عن الاستئصال: تتكون هذه الركيزة الخطية من منطقة DNA أساسية مزدوجة الشريط (dsDNA) مع أجزاء متدلية من الحمض النووي أحادي الشريط (ssDNA) ، والتي تحاكي نهايات الحمض النووي المقطوعة9. أربعة نيوكليوتيدات دقيقة في تيرميني من مناطق ssDNA تشفر كودون البداية للجين المراسل. إصلاح هذه الركيزة من خلال MMEJ يعيد إطار القراءة المفتوح لجين المراسل (ORF).
MMEJ المعتمد على الاستئصال: يتم مقاطعة الجين المراسل N-terminal exon بواسطة مقطع يحتوي على كودون توقف ، والذي يحيط به 8 ميكروهومولوجيات دقيقة لزوج القاعدة (bp). مطلوب استئصال نهاية التحلل النووي قبل الإصلاح بوساطة MMEJ لاستعادة جين المراسل السليم.
بلانت نهيج: ينقسم جين المراسل إلى أقسام طرفية N و C ، يتم وضع الأخير منها في المنبع من المروج. يتم إنتاج DSB باستخدام EcoRV ويتطلب الربط المباشر (بدون معالجة نهائية) بواسطة NHEJ لإعادة ربط كل من أجزاء جين المراسل واستعادة ORF للمراسل.
غير حادة NHEJ: يقع DSB داخل إنترون وسيكون له نهايات متماسكة أو غير متماسكة اعتمادا على اختيار إنزيم التقييد. يتطلب إصلاح هذه الركيزة بواسطة NHEJ أن يسبق الربط معالجة نهائية.
قالب طويل للموارد البشرية: ينقطع إكسون N-terminal لجين المراسل بواسطة مقطع الحمض النووي الذي يحتوي على مواقع التقييد ، والتي تحل محل 22 نقطة أساس من تسلسل جين المراسل الأصلي. لاستعادة هذا التسلسل ، يستخدم الإصلاح بواسطة HR قالب التماثل 2.5 كيلو قاعدة (kb) الموضوعة في اتجاه مجرى النهر من إكسون C-terminal.
نموذج قصير للموارد البشرية: يحل موقع التقييد اللازم لإنشاء DSB محل جزء من تسلسل جين المراسل الأصلي ويقدم كودون توقف في الإطار. مثل إصدار القالب الطويل ، تتطلب ركيزة الموارد البشرية هذه قالب التماثل النهائي (360 نقطة أساس) لإصلاح واستعادة المراسل ORF بدقة.
عسى: تحتوي هذه الركيزة على كودون توقف سابق لأوانه يقع داخل الإكسون الطرفي N للجين المراسل. تتطلب إزالة كودون التوقف هذا وإعادة تسلسل جين المراسل السليم إصلاحا بواسطة SSA ، والذي يتضمن استئصالا بعيد المدى ثنائي الاتجاه قبل محاذاة التماثلات.
لتوليد DSB ، يمكن هضم بعض ركائز المراسل باستخدام I-SceI (الشكل 1). سيؤدي ذلك إلى إنشاء ركيزة خطية ذات نهايات غير متماسكة في MMEJ المعتمدة على الاستئصال ، و NHEJ غير الحادة ، ومراسلي الموارد البشرية و SSA ذوي القوالب الطويلة ، والتي تحتوي على مواقع I-SceI جنبا إلى جنب في اتجاهات مقلوبة. في القالب القصير لركيزة مراسل الموارد البشرية ، سيؤدي هضم موقع I-SceI الفردي إلى إنشاء نهايات متماسكة. يمكن أيضا هضم NHEJ غير الحاد ، MMEJ المعتمد على الاستئصال ، القالب الطويل HR وبلازميدات SSA باستخدام HindIII ، والتي ستنتج نهايات متماسكة تكميلية.
نحن نقدم بروتوكولات لتوليد ركائز فحص المراسل ونصف كيف يمكن إجراء المقايسات ، ونقدم تفاصيل حول كيفية استخدامها لتحديد DSBR ، بما في ذلك الاستجابات القابلة للمعايرة للجزيئات الصغيرة ، وتقييم الفعالية الخلوية ، والنشاط على الهدف ، وانتقائية المسار.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، وصفنا بروتوكولات لتوليد وتنفيذ مجموعة من المراسلين القائمين على التلألؤ خارج الكروموسومات لقياس الكفاءة الخلوية لمسارات DSBR الرئيسية الأربعة (HR و NHEJ و MMEJ و SSA)7. يمكن إدخال ركائز المراسل في الخلايا عن طريق النقل العابر واستخدامها لتقييم نشاط DSBR باستخدام قراءات حساسة وقوية قائمة على اللوحة من تلألؤ NanoLuc ، والتي يتم إعادة تشكيلها عند التعامل مع مسارات DSBR الخلوية المماثلة.
تعد عدة مراحل من توليد الركيزة للمراسل ، ونقل الركائز إلى الخلايا ، وتفسير البيانات أمرا بالغ الأهمية للتنفيذ الناجح لهذه المقايسات. على الرغم من استخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية لتوليد ركائز المراسل ، فإن تصور العملية عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي يضمن أعلى جودة ونقاء للركائز قبل النقل. نظرا لأن هذه المقايسات تعتمد على النقل العابر ، تنطبق الاعتبارات الشائعة لهذه الطرق. ويشمل ذلك تحسين كثافة البذر ، وظروف النقل (بما في ذلك الكواشف وكميات الحمض النووي) ، وتقييم الملاءمة في تنسيقات النقل الأمامية والعكسية. تم إجراء فحوصات المراسلين هذه بنجاح باستخدام مجموعة من بروتوكولات التثقيب الكهربائي و lipofection ، ويجب استكشاف الخيارات بشكل كامل قبل إجراء هذه المقايسات. يجب أيضا توخي الحذر لفحص إشارات NanoLuc و Firefly المكونة بدلا من مجرد إشارة الإصلاح المركبة المشتقة من تطبيع إشارة NanoLuc (ركيزة المراسل) إلى إشارة Firefly (التحكم). يمكن أن تنشأ القطع الأثرية من النسبة التي تحركها التغييرات في إشارة Firefly. على سبيل المثال ، يجب أن يؤدي تقييم التثبيط في وضع الاستجابة للجرعة باستخدام مركب محدد للغاية إلى قمع إشارة NanoLuc بطريقة قابلة للمعايرة دون إزعاج إشارة Firefly ، والتي يجب أن تظل مستقرة (الشكل 4G ، H). ومع ذلك ، في الحالات التي تكون فيها إشارات Firefly مضطربة ، لا يزال من الممكن تحديد التأثيرات المفيدة على الإصلاح من خلال تحديد نافذة الجرعة حيث لا تتأثر إشارة Firefly (الشكل 5).
بالمقارنة مع مقايسات مراسل DSBR الأكثر استخداما ، فإن فحوصات المراسل القائمة على التلألؤ خارج الكروموسومات لها بعض المزايا المميزة. نظرا لأن مسارات DSBR محفوظة بشكل كبير ، حتى لو كانت الآلات الخلوية تختلف بين نماذج الخلايا ، فلا يزال بإمكان المقايسات الإبلاغ عن كفاءة DSBR واختيار المسار. هذا يفتح تقييم DSBR لأي نموذج يهم المستخدم ، طالما تم تحديد ظروف النقل العابر المثلى مسبقا.
يوفر استخدام Nanoluciferase كجين مراسل أيضا مزايا على خيارات الفلورسنت ، والتي تم استخدامها تقليديا في فحوصات مراسل DSBR. NanoLuc سريع النضج ويتم الكشف عن التلألؤ بحساسية عالية باستخدام قارئ لوحة8. إلى جانب سرعة إصلاح الركيزة (حيث يتم نقل ركائز المراسل إلى خلايا ذات نهايات DSB جاهزة للإصلاح) ، يعد هذا الشكل من مقايسة مراسل DSBR مثاليا للتحول السريع والمتانة الكمية المطلوبة لفحص الجزيئات الصغيرة كجزء من سلسلة اكتشاف الأدوية الصناعية. في الواقع ، لقد وصفنا مؤخرا تنفيذ مقايسة مراسل MMEJ المستقلة عن الاستئصال في سلسلة الاكتشاف المستخدمة لتحديد مثبطات الجزيئات الصغيرة في مجال Polθ polymerase13.
هناك أيضا مرونة في تنفيذ مقايسات المراسل لمعالجة أسئلة محددة حول الاضطرابات الجينية والدوائية ل DSBR (الشكل 3). على سبيل المثال ، قبل نقل ركائز المراسل ، يمكن نقل الخلايا باستخدام siRNA ضد جين مهم لمدة 48-72 ساعة. بدلا من ذلك ، يمكن اختبار آثار الإفراط في التعبير الجيني على مسارات DSBR عن طريق إجراء نقل البلازميد 24-48 ساعة قبل نقل ركائز المراسل. بالنسبة للدراسات الدوائية ، يصف البروتوكول الحالي بالفعل كيف يمكن دمج استخدام الجزيئات الصغيرة في سير العمل القياسي ، ولكن قد تتضمن الأشكال البديلة تغييرات في أنظمة المعالجة المركبة ، مثل الحضانة المسبقة أو الانجرافات.
يمكن أن تدعم قابلية التوسع في النقل العابر أيضا مناهج الفحص واسعة النطاق التي يتم فيها إجراء نقل دفعي لركائز المراسل قبل الفحص. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا أن تختلف مدة الفحص من النقل إلى القراءة. على الرغم من أن الفترات القياسية قد تكون 16-24 ساعة ، إلا أنه يمكن قراءة بعض المقايسات في أقل من 6 ساعاتو 7. يجب أيضا مراعاة المخاوف بشأن السمية من الجزيئات الصغيرة أو siRNA التي يمكن أن تعرض بقاء الخلية للخطر عند تحديد مدة الفحص.
باختصار ، توفر المقايسات الموضحة في هذه الدراسة والموصوفة بالكامل في منشور حديث7 تقييما سريعا وقويا لكفاءة DSBR الخلوية. فهي حساسة للغاية وقابلة للمعايرة ، مما يجعلها قابلة للدراسات الجينية والدوائية. بشكل حاسم ، نظرا لأنه يمكن إدخال ركائز المراسل إلى الخلايا عن طريق النقل العابر ، فإن لديها القدرة على استخدامها في أي نموذج خلية قابل للنقل ذي أهمية ، بدلا من تقييدها بخطوط خلايا محددة من خلال التكامل المستقر كما هو الحال مع مراسلي DSBR الكروموسومات. ومع ذلك ، فإن أحد القيود المميزة لهذه المقايسات خارج الكروموسومات هو أن عدم الاندماج في الجينوم قد لا يلخص بشكل كامل السياق الفسيولوجي والكروماتيني لإصلاح الحمض النووي والإشارات التنظيمية المرتبطة به والتنسيق15. تحقيقا لهذه الغاية ، تعد مقايسات المراسل خارج الكروموسومات مكملة للطرق الحالية لتقييم DSBR وتوسيع مجموعة أدوات الموارد المناسبة لكل من البحوث الأساسية واكتشاف الأدوية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل جميع الأعمال من قبل Artios Pharma Ltd. تم إنشاء الشكل 1 والشكل 3 باستخدام Biorender.com.
Materials
| 10x TBE buffer | Thermo Fisher | AM9863 | |
| 20% TBE-acrylamide gel | Invitrogen | EC6315BOX | |
| 50x TAE buffer | Fisher Scientific | BP13321 | |
| 6x Gel Loading Dye, Purple | NEB | B7024S | |
| 96-well white plate (with transparent bottom and lid) | Porvair | 204012 | |
| Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | For bead-based purification of DNA |
| Antarctic phosphatase and 10X buffer | NEB | M0289L | |
| CLARIOstar | BMG Labtech | 430-101 | Plate reader |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Cell counter |
| Custom oligonucleotides | Sigma-Aldrich | Custom order | For resection-independent MMEJ substrate. See Table 2. |
| D300e | Tecan | 30100152 | DMSO-based compound dispenser |
| D300e D4+ cassette | Tecan | 30097371 | High volume cassette for D300e compound dispenser |
| D300e T8+ cassette | Tecan | 30097370 | Low volume cassette for D300e compound dispenser |
| Dimethyl sulfoxide, cell culture grade | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Vehicle for compounds, used in Figure 4 and Figure 5 |
| DSBR reporter source plasmids | Artios | Available to the academic community upon request | |
| EcoRV-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3195M | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.365 | |
| Foetal Bovine Serum | PAN-Biotech | P30-3031 | |
| GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder | Thermo Fisher | SM1211 | Low molecular weight DNA ladder |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | Example cell line used in protocol |
| HindIII-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3104M | |
| HyClone Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | 10275262 | |
| I-SceI and 10x Tango Buffer | Invitrogen | ER1771 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.33 | |
| JetPRIME reagent and buffer | PolyPlus | 114-15 | Lipid-based transfection reagent |
| MegaStar 1.6 | VWR | 521-1749 | Centrifuge for 15 or 50 mL tubes |
| MEM Eagle | PAN-Biotech | P04-08056 | Culture medium for HEK-293 cells |
| Microplate shaker | Fisherbrand | 15504070 | Microplate orbital shaker |
| MicroStar 17R | VWR | 521-1647 | Centrifuge for 1.5 or 2 mL tubes |
| MultiDrop | Thermo Fisher | 5840300 | Cell or water-based reagent dispenser |
| MultiDrop Standard Cassette | Thermo Fisher | 24072670 | Cassette for MultiDrop reagent dispenser |
| NanoDLR Stop & Glo Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Reporter luciferase (NanoLuc) reagent to quench Firefly luminescence and detect NanoLuc luminescence. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
| ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Control luciferase (Firefly) assay reagent to detect Firefly. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
| PBS (without calcium or magnesium) | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| pGL4 Firefly plasmid (or similar) | Promega | E1310 (or equivalent) | Firefly control plasmid |
| pNL1.1 NanoLuc plasmid (or similar) | Promega | N1091 (or equivalent) | NanoLuc control plasmid, for adjustment of equipment settings/optimisation experiments |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| Quick-Load Purple 1 kb DNA Ladder | NEB | N0552S | High molecular weight DNA ladder |
| Sodium Acetate (3 M), pH 5.5 | Thermo Fisher | AM9740 | For pH adjustment during gel extraction with QIAquick Gel Extraction Kit |
| SYBR Gold (10,000x) | Invitrogen | S11494 | For visualisation of ssDNA and dsDNA |
| SYBR Safe (10,000x) | Invitrogen | S33102 | For visualisation of dsDNA only |
| T4 DNA Ligase and 10x Ligase buffer | NEB | M0202L | |
| Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | For measurement of viability during cell counting |
| Trypsin-EDTA solution; 0.25% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| XhoI and 10x CutSmart buffer | NEB | R0146M |
References
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).
- Ramsden, D. A., Carvajal-Garcia, J., Gupta, G. P. Mechanism, cellular functions and cancer roles of polymerase-theta-mediated DNA end joining. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 125-140 (2022).
- Ceccaldi, R., et al. Homologous-recombination-deficient tumours are dependent on Polθ-mediated repair. Nature. 518 (7538), 258-262 (2015).
- Bvan de Kooij, B., van Attikum, H. Genomic reporter constructs to monitor pathway-specific repair of DNA double-strand breaks. Front Genet. 12, 809832 (2021).
- Gunn, A., Stark, J. M. I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks. Methods Mol Biol. 920 (9), 379-391 (2012).
- Rajendra, E., et al. Quantitative, titratable and high-throughput reporter assays to measure DNA double strand break repair activity in cells. Nucleic Acids Res. 52 (4), 1736-1752 (2024).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- Wyatt, D. W., et al. Essential roles for polymerase θ-mediated end joining in the repair of chromosome breaks. Mol Cell. 63 (4), 662-673 (2016).
- Wood, R. D., Doublié, S. Genome protection by DNA polymerase θ. Annu Rev Genet. 56, 207-228 (2022).
- Belan, O., et al. POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells. Mol Cell. 82 (24), 4664-4680.e9 (2022).
- Zatreanu, D., et al. Polθ inhibitors elicit BRCA-gene synthetic lethality and target PARP inhibitor resistance. Nat Commun. 12 (1), 3636 (2021).
- Stockley, M. L., et al. Discovery, characterization, and structure-based optimization of small-molecule in vitro and in vivo probes for human DNA polymerase theta. J Med Chem. 65 (20), 13879-13891 (2022).
- Scott, D. E., et al. A small-molecule inhibitor of the BRCA2-RAD51 interaction modulates RAD51 assembly and potentiates DNA damage-induced cell death. Cell Chem Biol. 28 (6), 835-847.e5 (2021).
- Schep, R., et al. Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance. Mol Cell. 81 (10), 2216-2230.e10 (2021).
.