Live Fluorescence Microscopy를 사용한 인간 결장 오가노이드의 Cytokine 유도 세포 사멸 정량화

대장 점막 생검은 표준 치료의 일환으로 정기적인 대장 내시경 검사를 받는 CD 환자로부터 수집되었습니다. 환자 조직 샘플의 사용 및 이러한 샘플에서 결장 오가노이드 라인 생성에 대한 윤리적 승인은 Cork Teaching Hospitals(CREC)의 임상 연구 윤리 위원회(Clinical Research Ethics Committee)로부터 획득했습니다. 헬싱키 선언에 동의하여 모든 환자로부터 서면 동의서를 받았습니다. 환자 생검 및 결장체를 포함한 모든 조직 배양 작업은 BSL2 안전 프로토콜에 따라 생물 안전 캐비닛 내에서 수행해야 합니다. 사용하기 전에 모든 플라스틱 마모가 멸균 상태인지 확인하십시오. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 시약, 기기 및 소프트웨어와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 우리 그룹이 크립트 격리 및 오가노이드 배양을 위해 사용하는 프로토콜은 확립된 방법 14,15,16 에서 채택되었으며이전에 발표된 9,10,17입니다. 다음 프로토콜의 경우, 콜로노이드는 오가노이드 증식 배지를 사용하여 배양하였다(표 1). Organoid Proliferation Media를 사용하여 성장한 대장형은 미분화되어 대장 줄기세포에 대해 농축됩니다. 오가노이드 증식 배지의 주요 구성 요소는 장 줄기 세포 틈새 성장 인자 Wnt-3A(W), R-spondin 3(R) 및 Noggin(N)15를 포함하는 50% L-WRN 컨디셔닝 배지입니다. 오가노이드 증식 배지는 L-WRN 컨디셔닝 배지와 무혈청 배지를 1:1로 결합한 후 니코틴아미드와 화학 억제제를 보충하여 제조합니다(표 1). 1. 대장 크립트 격리 및 대장 배양 크립트로 파종하기 전에 37°C, 5% CO2 에서 최소 72시간 동안 48웰 마이크로타이터 플레이트를 사전 배양합니다.참고: 플레이트를 사전 배양하면 파종 중에 기저막 추출물(BME)의 중합이 가속화됩니다. 크립트를 격리하기 전날 저녁 4 ° C의 얼음으로 BME를 해동하십시오. 15mL의 생검 수집 배지(표 1)가 들어 있는 검체 채취 튜브에 대장 생검을 수집하고 처리 준비가 될 때까지 4°C에서 보관합니다. 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 생검 수집 배지를 조심스럽게 제거합니다. 2.5 μg/mL 암포테리신 B 및 100 μg/mL 겐타마이신이 보충된 얼음처럼 차가운 DPBS 15mL를 시료 튜브에 추가하여 생검을 세척합니다. 생검에서 점액이나 파편을 분리하기 위해 샘플 튜브를 세게 흔듭니다. 생검이 중력에 의해 가라앉도록 하고 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 DPBS를 조심스럽게 제거합니다.1.4단계부터 세척 절차를 두 번(2회) 반복합니다. 2.5 μg/mL 암포테리신 B 및 200 μg/mL 겐타마이신이 보충된 무효소 세포 해리 시약 10mL를 시료 튜브에 넣고 실온에서 30rpm에서 흔들면서 15분 동안 배양합니다. 배양 후 검체 튜브를 손으로 좌우로 세게 흔들어 결장 크립트를 풀어줍니다. 저출력 광학 현미경을 사용하여 튜브를 검사하고 방출된 크립트와 현탁액 조각이 있는지 확인합니다. 보이지 않으면 튜브를 흔들어 다시 확인하십시오. 크립트가 중단될 때까지 반복합니다. 70μm 세포 여과기를 50mL 튜브에 부착하고 여과기를 통해 크립트 현탁액을 여과합니다. 빈 샘플 튜브에 얼음처럼 차가운 오가노이드 세척 배지 10mL(표 1)를 추가하고 배지를 제거한 다음 세포 여과기를 통과시킵니다. 여과된 크립트를 2개의 15mL 튜브(튜브당 10mL)에 옮기고 4°C에서 150× g에서 5분 동안 원심분리합니다. 각 15mL 튜브에서 상층액을 조심스럽게 제거하고, 500μL의 얼음처럼 차가운 오가노이드 세척 매체에 크립트 펠릿을 재현탁하고, 두 15mL 튜브의 크립트 용액을 단일 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮기고, 4°C에서 400× g에서 3분 동안 원심분리합니다. 미세 원심분리기 튜브에서 상층액을 조심스럽게 제거하고 크립트 펠릿을 70μL의 BME(웰당 20μL 및 추가 데드 볼륨 10μL)에 재현탁시킵니다. 사전 배양된 48웰 플레이트(단계 1.1)를 사용하여 각 웰의 중앙에 20μL의 BME/크립트 현탁액을 파종합니다(웰당 1개의 BME 돔). 플레이트를 부드럽고 꾸준히 뒤집고 37 ° C, 5 % CO2 에서 20 분 동안 배양합니다.알림: 플레이트를 뒤집으면 세포가 웰의 플라스틱 표면에 달라붙는 것을 방지하고 BME 내에서 세포가 분포되도록 합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. BME가 완전히 중합되었는지 확인한 다음 100μg/mL의 광범위한 항균 시약이 보충된 350μL의 사전 예열된 오가노이드 증식 매체로 돔을 오버레이합니다. 플레이트를 37 ° C, 5 % CO2 에서 배양합니다.참고: 광범위한 항균 시약은 결장 생검과 관련된 점막 미생물로 인한 오염을 방지하기 위한 것입니다. 크립트 격리 후 배양 첫 주에만 필요합니다. 미리 워진 오가노이드 증식 배지를 사용하여 일주일 안에 배지를 2-3번 교체하고 배양 첫 주에 광범위한 항균 시약을 보충합니다. 이 기간이 지나면 시약을 제거하십시오. 대장 배양이 완전히 확립되면(분리 후 1-2주 후) ROCK-I/II 억제제 Y-27632 10μM이 보충된 효소 해리 시약을 사용하여 대장을 해리합니다(결장 해리에 대한 자세한 내용은 섹션 2 참조).참고: 처음 두 구절(P0-1, P1-2)의 경우 결장체는 1:1/2 비율을 사용하여 확장해야 합니다. P2 이후에는 1:3/4 비율로 대장을 통과시킬 수 있습니다. 1.11-1.13 단계에 따라 결장체를 파종하고 유지 관리합니다(오가노이드 증식 매체에 광범위한 항균 시약을 보충하지 않음). 2. 세포 사멸 분석을 위한 콜로노이드 제조 참고: 세포 사멸 분석 프로토콜은 완료하는 데 4일이 걸립니다(그림 1A). 48웰 플레이트 형식을 사용하여 콜로노이드를 확장하고, 웰당 20μL의 BME/crypt 현탁액을 파종하고, 37°C, 5% CO2에서 배양하고, 배지를 일주일에 2-3번(웰당 350μL) 교체합니다. 세포 사멸 분석을 위해 수확하기 약 1주일 전에 결장체를 통과시킵니다. 콜로노이드를 수확하기 전에 콜로노이드가 고밀도로 증식하는지(그림 1Bi), 직경이 약 25-50μm이고 활발하게 증식하고 있는지 확인하십시오.참고: 이 분석에는 3번 구절에서 14번 구절까지 일관된 결과를 가진 대장을 사용했습니다. 그러나, 사이토카인에 대한 콜로노이드의 전사 반응은 배양 기간에 따라 변할 수 있음이 입증되었다18. 이를 바탕으로 15번 통과 후에는 이 분석에 결장제를 사용하지 않는 것이 좋습니다. 대장 세포로 파종하기 전에 37 °C, 5 % CO2 에서 최소 72 시간 동안 96-well microtiter plate를 사전 배양합니다. 실험을 시작하기 전날 저녁 4°C의 얼음으로 BME를 해동합니다. ROCK-I/II inhibitor Y-27632 10 μM을 보충하여 충분한 양의 효소 해리 시약(결장형 웰당 500 μL)을 준비합니다. 결장종이 들어있는 웰에서 배지를 부드럽게 제거하십시오. 결장 돔의 손상을 방지하기 위해 우물 가장자리에서 피펫을 제거합니다. 각 웰에 300μL의 효소 해리 시약을 추가합니다.각 웰에 대해 P1000 피펫 팁으로 웰 표면을 긁어내고 세포 현탁액을 위아래로 피펫팅하여 결장형 돔을 분리합니다. 기포가 발생하지 않도록 하십시오. 세포 현탁액을 15mL 튜브에 수집합니다.참고: 이 15mL 튜브는 48웰 플레이트의 10웰에서 콜로노이드를 수집하는 데 사용됩니다. 다른 200μL의 효소 해리 시약으로 동일한 웰을 세척하여 모든 결장 물질이 수집되어 동일한 15mL 튜브로 전달되도록 합니다. 채취하는 팽창된 결장체의 각 웰에 대해 이 과정을 반복하고 동일한 단일 15mL 튜브에 수집합니다.알림: 효율적인 해리를 위해 튜브당 최대 10개의 콜로노이드 웰을 수집해야 합니다. >10 웰을 수집하는 경우 수집된 대장을 여러 개의 15mL 튜브에 균등하게 분할합니다. 2.5.2단계에서 채취한 대장체가 있는 15mL 튜브를 37°C의 수조에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후 튜브를 400× g에서 3분 동안 원심분리합니다. 튜브에 약 1.2mL를 남기고 상층액을 부드럽게 제거합니다.참고: 다음 단계에서는 신속한 피펫팅을 사용하여 대장종을 물리적으로 분리해야 합니다. 이것이 효과적이려면 튜브에 소량의 세포 현탁액이 있어야 하며, 15mL 튜브에 남아 있는 1.2mL면 이 목적에 충분합니다. 효소 해리 시약의 나머지 1.2mL에 결장 펠릿을 재현탁시킵니다. 1,000 μL로 설정된 P1000 피펫을 사용하여 피펫의 팁을 15 mL 튜브의 바닥 바로 위에 놓고 현탁액을 팁 안팎으로 빠르게 피펫팅합니다. 빠르게 피펫팅하려면 플런저 버튼을 첫 번째 정지까지 빠르게 누르고 상단 위치의 대략 절반이 될 때까지 버튼에서 손을 뗀 다음 반복합니다. 약 10초(30-40회 함몰) 동안 빠르게 피펫팅한 다음 현탁액을 완전히 현탁하고 피펫팅을 반복합니다. 2-3회 연속 빠른 피펫팅을 수행합니다. 현미경으로 샘플을 확인하여 전체 결장종이 남아 있지 않고 대부분의 결장 단편 조각이 약 30-40μm 크기인지 확인합니다(그림 1Bii). 샘플에 추가 해리가 필요한 경우 37°C의 수조에서 3분 더 배양하고 2.7단계에서 피펫팅 기술을 반복한 다음 현미경으로 샘플을 확인합니다. 대부분의 결장 조각이 최적의 크기가 될 때까지 이 과정을 반복합니다.알림: 대장을 너무 많이 해리하면 과도한 세포 사멸, 낮은 도금 효율 및 작은 크기의 결장종이 발생할 수 있으므로 주의하십시오. 15mL 튜브에 얼음처럼 차가운 오가노이드 세척 매체(표 1) 10mL를 추가합니다. 400 × g에서 3분 동안 튜브를 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 1mL의 얼음처럼 차가운 오가노이드 세척 매체에 재현탁한 다음 1.5mL 미세 원심분리기 튜브( 대장 절편 튜브라고 함)로 옮깁니다. 피펫팅으로 결장 절편 튜브 의 내용물을 혼합하고 50μL 샘플을 채취합니다. 이 50μL 샘플을 새로운 1.5mL 미세 원심분리기 튜브( 세포 계수 튜브라고 함)로 옮깁니다. 이 시점부터 2.15단계가 완료될 때까지 결장 절편 튜브 를 얼음 위에 보관하십시오. 세포 계수 튜브를 400 × g에서 3분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 10 μM의 ROCK-I/II 억제제 Y-27632가 보충된 500 μL의 효소 해리 시약에 재현탁시킵니다. 단일 세포 계수 튜브 를 37°C의 수조에서 5분 동안 배양합니다. 400 μL로 설정된 P1000 피펫을 사용하여 2.7단계에 설명된 대로 샘플을 피펫팅하고 현미경으로 샘플을 확인하여 단일 셀 현탁액이 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 결장체가 단세포 현탁액으로 완전히 해리될 때까지 이 과정을 반복합니다. 단일 세포 계수 튜브에 1mL의 오가노이드 세척 배지를 추가하고 400× g 에서 3분 동안 원심분리한 다음 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 50 μL의 오가노이드 세척 배지에 세포를 재현탁시킨 다음 50 μL의 트리판 블루를 추가합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 50μL 샘플의 세포 수를 계산하고 이를 사용하여 결장 절편 튜브의 세포 농도를 계산합니다. 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰당 0.5 × 104개의 결장 세포가 파종되는 실험에 필요한 세포 현탁액의 부피를 계산합니다. 데드 볼륨을 설명하기 위해 이 계산된 볼륨에 약 15%를 추가합니다. 이 총 부피를 대장 절편 튜브 (단계 2.11)에서 새 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.결장체 단편이 포함된 새로운 1.5mL 미세 원심분리기 튜브를 400× g에서 3분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한 다음 BME에 재현탁시킵니다(0.5 × 104 세포당 10μL의 BME 사용).참고: BME(고점도, 온도에 따른 중합)의 물리적 특성으로 인해 피펫팅(데드 볼륨)을 통해 상당한 양의 물질이 손실될 수 있습니다. 결장체/BME 현탁액이 들어 있는 튜브 또는 저장소를 생물 안전 캐비닛 내부의 멸균 용기에 넣어 얼음에 설치합니다.참고: 파종하는 동안 세포를 얼음 위에 유지하면 세포 기질이 조기에 중합되는 것을 방지할 수 있습니다. 사전 배양된 96웰 마이크로타이터 플레이트(2.3단계에서)를 사용하여 웰당 10μL의 결장체/BME 용액을 역피펫팅합니다. 웰 표면 바로 위에 팁을 배치하고 웰 벽에 부딪히지 않도록 피펫을 중앙에 배치해야 합니다. 고르지 않은 파종을 방지하기 위해 결장종/BME 현탁액을 정기적으로 혼합하십시오.참고: microtiter 플레이트의 바깥쪽 가장자리 웰에 콜로노이드를 파종하지 마십시오.파이펫을 반대로 하는 방법:피펫을 설정한 다음 첫 번째 정지를 지나 두 번째 정지까지 플런저 버튼을 누릅니다. 이 위치를 잡고 팁을 결장형/BME 서스펜션에 담그고 플런저를 위로 천천히 풉니다. 플런저 버튼을 첫 번째 정지까지 부드럽고 꾸준히 눌러 서스펜션을 분배합니다. 더 많은 우물을 파종하는 경우 이 위치를 유지하고 2.18.1.2-2.18.1.3단계를 반복합니다. 완료되면 플런저 버튼을 두 번째 정지 지점으로 눌러 소량의 남아 있는 서스펜션을 배출합니다.참고: BME의 점도가 높기 때문에 역 피펫팅 기법을 사용하는 것이 좋습니다. 플레이트를 부드럽고 꾸준히 뒤집고 37 ° C, 5 % CO2 에서 20 분 동안 배양합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. BME가 완전히 중합되었는지 확인한 다음 200μL의 사전 예열된 오가노이드 증식 매체로 돔을 오버레이합니다. 주변 해자(증발 감소)가 있는 96웰 마이크로타이터 플레이트를 사용하는 경우 각 저장소에 2mL의 오가노이드 세척 매체를 채웁니다. 대장을 37 °C, 5 % CO2 에서 3 일 동안 배양하고 하루에 한 번 현미경으로 검사하여 대장 세포가 회복되어 증식하고 있는지 확인합니다. 3. 세포 사멸 분석을 위한 대장 질환 치료 예열된 오가노이드 증식 매체에 형광 세포 사멸 염료 또는 DMSO를 첨가하여 형광 세포 사멸 염료(SYTOX Green Nucleic Acid Stain) 및 DMSO 용액의 2.5μM 용액을 준비합니다(표 2).알림: 형광 세포 사멸 염료 스톡과 희석된 용액을 빛으로부터 보호하십시오. SYTOX Green Nucleic Acid Stain은 DMSO에 용해됩니다. DMSO 용액은 용매 효과를 제어하기 위해 No Dye 조건을 준비하는 데 사용됩니다. 3.1단계의 형광세포 사멸 염료 및 DMSO 용액 2.5μM 용액을 사용하여 표 2와 같이 처리체를 준비합니다. 플레이트를 기울이고 웰 가장자리에서 피펫팅하여 콜로노이드가 파종된 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 배지를 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 웰당 200μL의 처리 배지를 추가합니다. 최대 독성 조건에 대한 추가 PBS/BSA 제어 웰이 있는지 확인하십시오(플레이트 맵은 표 2 참조). 이미징 준비가 될 때까지 필요한 치료 시점 동안 37°C, 5% CO2 에서 대장을 배양합니다. 이미징하기 최소 2시간 전에 멸균 세포 배양 등급 물에 Triton-X 100의 10% v/v 용액을 준비하고 이미징 전 1시간 전에 최종 농도 1% v/v 1이 되도록 최대 독성 조건에 대한 대조군 웰의 매체에 10% Triton-X 100 22μL를 직접 추가합니다.참고: 10% 용액을 사용하면 계면활성제의 높은 점도로 인해 발생할 수 있는 피펫팅 오류를 줄일 수 있습니다. 4. 이미지 취득 인큐베이터에서 콜로노이드가 파종된 96웰 마이크로타이터 플레이트를 제거하고 디지털 도립 에피형광 현미경의 스테이지로 옮깁니다. 접시가 실온에 오도록 합니다. Max Toxicity 조건 결장종이 현미경으로 검사하여 완전히 용해되었는지 확인합니다(그림 1Biii). 긴 working distance 40x fluorescence objective와 같은 적합한 대물렌즈를 선택하십시오. 시작하기 전에 현미경의 이미징 설정을 최적화하십시오.전송 채널을 사용하여 SYTOX 양성 세포가 있는 결장체에 초점을 맞추고 녹색 형광 단백질(GFP)로 전환합니다.채널(488nm)을 설정하고 광 강도와 노출 시간을 조정하여 배경을 최소화하면서 형광 신호를 최대화합니다. 먼저 낮은 조명 강도를 시도한 다음 점차적으로 노출 시간을 늘리십시오. 노출 시간이 실용적이지 않으면 빛의 강도를 약간 높이십시오.참고: 빛의 강도 대신 노출 시간을 늘리면 샘플의 광독성과 광표백이 감소합니다19. 필요한 경우에만 샘플을 형광등에 노출시키십시오. GFP 채널에 최적화된 이미징 설정을 사용하여 No Dye 및 Max Toxicity 조건을 관찰하여 샘플이 과다 또는 과소 노출되지 않도록 합니다. 완료되면 조건 간에 이미징 설정을 일관되게 유지합니다. 무작위 샘플링 접근 방식을 사용하여 이미지 획득: 대장 돔을 덮는 고정된 그리드 패턴을 따르는 시야(FOV)를 선택하여 이 작업을 수행합니다. 최소 10개의 FOV에서 대장의 이미지를 획득합니다. 결장체의 중심면에 초점이 맞춰져 있는지 확인하고 투과 채널과 GFP 채널 모두에서 이미지를 획득합니다.다음 제외 기준을 적용합니다.FOV에 결장종이 없는 경우 이미지를 획득하지 마십시오. FOV에 존재하는 동일한 초점면에서 겹치는 결장체만 있는 경우 이미지를 획득하지 마십시오(그림 1Biv). FOV에 결장 이물질만 있는 경우 이미지를 획득하지 마십시오(그림 1Bv). 분석에 결장 이물질을 포함하지 마십시오. 휴대용 네트워크 그래픽 형식으로 이미지를 저장하고 내보낼 수 있습니다. 추가 시점을 이미징하는 경우 콜로노이드가 있는 96웰 마이크로타이터 플레이트를 37°C, 5%CO2의 인큐베이터로 되돌립니다. 5. 이미지 분석 Fiji ImageJ를 열고 파일을 ImageJ 도구 모음으로 끌어다 놓거나 파일 | 파일을 열고 선택합니다. 열리면 Image| 스택| 쌓을 이미지. 를 클릭하여 이미지 스택을 8비트 파일 형식으로 변환 하려면 Image| 유형| 8비트. 각 이미지 세트에 대해 ImageJ 도구 모음에서 자유형 선택 도구를 클릭하고 컴퓨터 마우스를 사용하여 전송 이미지의 관심 영역(ROI)을 수동으로 선택합니다. ROI는 대장형의 둘레입니다. 그런 다음 이미지 스택을 해당 GFP 채널 이미지로 전환합니다. Analyze(분석)를 클릭합니다. 측정 설정; Set Measurements(측정 설정) 대화 상자 창에서 Mean Grey Value(평균 회색 값)를 선택하고 다른 모든 상자는 선택 취소합니다. GFP 이미지를 선택한 상태에서 Analyze(분석) | 측정. 이미지 스택의 모든 결장체에 대해 이 분석을 반복합니다. 데이터 세트가 분석되면 결과 창의 모든 데이터를 복사하여 스프레드시트 소프트웨어 애플리케이션에 붙여넣습니다. 6. % 최대 독성 계산 방정식 (1)을 사용하여 각 조건에 대한 기술 반복실험 MGV(Mean Grey Values)의 평균을 계산합니다. (처리 평균: a) = (1) 각 조건의 평균을 방정식 (2)를 사용하여 최대 독성 조건(MT)의 평균에 상대적인 백분율로 표현합니다.%MTa = (2) 7. CPI 계산 6.1단계에서 계산된 평균값을 사용하여 다음과 같이 데이터를 정규화(NORM)하고 각 처리 조건과 최대 독성(MT) 조건에서 치료되지 않은 상태(UT)의 평균을 뺍니다(사이토카인 처리와 무관하게 발생하는 배경 세포 사멸을 제거하기 위해). 그런 다음, 식 (3)과 같이 각 처리 조건을 최대 독성(MT) 조건의 배경 빼기 평균으로 나눕니다.규범A = (3) 7.1 단계에서 계산 된 정규화 된 값을 1에서 뺍니다. 결과 값은 처리 후 세포 생존율(V)을 나타냅니다(아래 수학식 4와 같이).Va = 1 −NORMa (4) 방정식 (5)를 사용하여 섭동 교호작용 계수(CPI)를 계산합니다.CPI = (5)여기서 a 는 첫 번째 처리를 나타냅니다. b 는 두 번째 처리를 나타냅니다. Ab 는 조합 치료입니다. CPI 값은 시너지 효과(1) 관계를 나타냅니다.