급성 LCMV에 감염된 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 CD4+ T 세포의 조기 분화에 접근
Summary
현재 연구는 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신을 평가하고 이러한 세포에서 유전자 발현을 조작하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.
Abstract
Follicular Helper T (TFH) cell은 동족 B 세포가 친화성이 높은 항체를 생성하여 장기적인 체액성 면역을 형성하는 데 도움을 주는 독립적인 CD4+ T 세포 계통으로 인식됩니다. 급성 바이러스 감염 시 바이러스 특이적 TFH 세포의 운명 결정은 초기 감염 단계에서 결정되며, 조기 분화된 TFH 세포에 대한 연구는 T 세포 의존성 체액성 면역을 이해하고 백신 설계를 최적화하는 데 중요합니다. 이 연구에서는 급성 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV) 감염 마우스 모델과 LCMV 당단백질 에피토프 I-AbGP66-77을 특이적으로 인식하는 CD4+ T 세포를 가진 TCR-transgenic SMARTA(SM) 마우스를 사용하여 유세포 염색을 기반으로 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신에 접근하는 절차를 설명했습니다. 또한, SM CD4+ T 세포의 레트로바이러스 transduction을 이용하여 조기 분화된 바이러스 특이적 TFH 세포에서 유전자 발현을 조작하는 방법도 제공합니다. 따라서 이러한 방법은 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 투여의 기저에 있는 메커니즘을 탐색하는 연구에 도움이 될 것입니다.
Introduction
다양한 병원체나 위협에 직면했을 때, 미성숙 CD4+ T 세포는 특화된 기능을 가진 다양한 보조 T(TH) 세포 subset으로 분화하여 면역 반응을 조정합니다1. 급성 바이러스 감염 시나리오에서 naive CD4+ T 세포의 상당 부분은 B 세포 2,3에 도움을 제공하는 여포 도우미 T(TFH) 세포로 분화합니다. 다른 CD4+ TH 세포 subset(예를 들어, TH1, TH2, TH9 및 TH17 세포)와 구별되듯이, TFH 세포는 상당한 수준의 CXCR5를 발현하는데, 이는 B 세포 귀환 chemokine CXCL13에 대한 chemokine 수용체로서, TFH 세포가 B 세포 소낭선으로 이동할 수 있게 한다. B 세포 난포에서 TFH 세포는 생식 중심 반응을 시작하고 유지하는 데 있어 B 세포를 동족 형성을 지원하여 빠른 고친화성 항체 생산과 장기 체액성 기억을 가능하게 합니다 2,3.
급성 바이러스 감염 시, 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 결정은 72 h 4,5 이내에 발생하며, TFH 세포 운명 결정을 관장하는 “마스터 조절자” 역할을 하는 전사 억제 인자 B 세포 림프종-6(Bcl-6)5,6,7,8에 의해 조절됩니다. Bcl-6의 결핍은 TFH 세포 분화를 심각하게 둔화시키는 반면, 이소성 Bcl-6 발현은 TFH 세포 운명 헌신을 실질적으로 촉진합니다. Bcl-6 외에도 여러 분자가 초기 TFH 세포 운명 헌신을 지시하는 데 관여합니다. 전사 인자 TCF-1 및 LEF-1은 Bcl-6 9,10,11의 유도를 통해 TFH 세포 분화를 시작합니다. Bcl-6 및 TCF-1 모두에 의한 Blimp1의 억제는 초기 TFH 세포 운명 헌신11,12에 필요합니다. STAT1 및 STAT3는 초기 TFH 세포 분화에도 필요합니다13. 게다가, 히스톤 메틸전이효소 EZH214,15 및 m6A 메틸전이효소 METTL316에 의한 후성유전학적 변형은 TFH 세포 전사 프로그램(특히 Bcl6 및 Tcf7)을 안정화하는 데 도움이 되므로 초기 TFH 세포 운명 헌신을 촉진합니다. 앞서 언급한 분자 및 다른 분자를 포함한 발전이 다른 곳에서 요약된3, 초기 TFH 세포 운명 헌신의 전사 및 후성유전학적 규칙을 이해하는 데 이루어졌지만, 이전에 알려지지 않은 분자는 학습되어야 할 과제로 남아 있습니다.
급성 림프구성 맥락막염 바이러스(LCMV) 감염의 마우스 모델에서, LCMV 당단백질 에피토프 I-AbGP66-77을 특이적으로 인식하는 입양 전달 동종성 TCR-형질전환 SMARTA(SM) CD4+ T 세포는 바이러스 감염 중에 TFH 또는 TH1 세포 분화를 겪습니다. 이 TFH/TH1 분기 분화 패턴은 바이러스 특이적 TFH 세포의 생물학을 연구하는 데 있어 SM/급성 LCMV 감염 모델의 발전을 지원합니다. 실제로, SM/급성 LCMV 감염 모델은 TFH 세포 연구 분야에서 널리 사용되어 왔으며 TFH 세포 생물학의 이정표적 발견에 중요한 역할을 했습니다. 여기에는 TFH 세포 5,6의 계통 정의 전사 인자로서의 전술한 Bcl-6의 식별뿐만 아니라 T FH 세포분화를 안내하는 다른 중요한 전사 인자(예: Blimp-16, TCF-1/LEF 9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218 및 Itch19)가 포함되며, TFH 세포 분화, 전사 후 규정( 예를 들어, TFH 세포 분화, TFH 세포 기억 및 가소성21,22, 및 TFH 세포를 표적으로 하는 합리적인 백신 접종 전략(예: 셀레늄23)의 METTL316 및 miR-17~9220)을 포함할 수 있다.
본 연구는 (1) 조기 분화된 TFH 세포에 접근하는 데 적합한 급성 LCMV 감염 SM 키메라 마우스 모델 확립, (2) 조기 분화 TFH 세포와 관련된 분자의 유세포 분석 염색 수행, (3) SM CD4+에서 레트로바이러스 벡터 기반 유전자 조작 수행을 포함하여 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신에 접근하기 위한 재현 가능한 방법을 설명합니다 T 세포. 이러한 방법은 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신을 조사하는 연구에 유용할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
TFH 세포 분야의 연구는 B 세포를 돕는 TFH 세포의 특화된 기능이 발견된 이후 주목을 받았습니다. 축적된 연구는 TFH 세포 분화가 다단계 및 다인자 과정(multistage and multifactorial process)이라는 것을 나타냈다(30), 여기서 TFH 세포 운명 헌신은 초기 단계(early stage5)에서 결정된다. 따라서 조기 분화된 TFH 세포의 기전을 더 잘 이?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 32300785에서 X.C.까지), 중국 국가 혁신 인재 박사 후 과정 (No. BX20230449 to X.C.), 국가 과학 기술 전공 프로젝트(No. 2021YFC2300602 to L.Y.).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA | Beyotime | P0099-500mL | |
| 70 μm cell strainer | Merck | CLS431751 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1) | Biolegend | 127812 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20) | Biolegend | 110724 | 1:200 dilution |
| APC anti-mouse CD25 (clone PC61) | Biolegend | 101910 | 1:200 dilution |
| B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BeaverBeads Streptavidin | Beaver | 22321-10 | |
| Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8) | Biolegend | 123106 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418) | Biolegend | 117304 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136) | Biolegend | 108704 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119) | Biolegend | 116204 | 1:200 dilution |
| bovine serum albumin, BSA | Sigma | A7906 | |
| Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10) | Biolegend | 644816 | 1:100 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12) | Biolegend | 135220 | 1:200 dilution |
| C57BL/6J (B6) mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CXCR5-GFP knock-in reporter mouse | In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5. | ||
| DMEM 10% medium | DMEM medium containing 10% FBS | ||
| DMEM medium | Gibco | 11885092 | |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| FACSFortesa | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum, FBS | Sigma | F8318 | |
| FlowJo (version 10.4.0) | BD Biosciences | ||
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer. |
| Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated | Vector laboratories | BA-9400-1.5 | 1:200 dilution |
| Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | ||
| Isolation buffer | FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA | ||
| LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV) | Chinese Peptide Company | ||
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | 1:200 dilution |
| MigR1 | addgene | #27490 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Opti-MEM medium | Gibco | 31985070 | |
| pCL-Eco | addgene | #12371 | |
| PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3) | Biolegend | 104508 | 1:200 dilution |
| PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91) | BD Biosciences | 561522 | 1:50 dilution |
| Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010072 | |
| Polybrene | Solarbio | H8761 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8) | BD Biosciences | 551961 | 1:50 dilution |
| Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5) | Biolegend | 100538 | 1:200 dilution |
| recombinant murine IL-2 | Gibco | 212-12-1MG | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Beyotime | C3702-500mL | |
| RPMI 1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI 2% | RPMI 1640 medium containing 2% FBS | ||
| SMARTA (SM) TCR transgenic mouse | SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450). | ||
| Staining buffer | PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3 | ||
| Streptavidin PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4317-82 | 1:200 dilution |
| TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) | Cell signaling technology | 6444S | 1:400 dilution |
| TFH cell staining buffer | FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum | ||
| TransIT-293 reagent | Mirus Bio | MIRUMIR2700 |
References
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