Laboratory Maintenance of the Lower Dipteran Fly <i>Bradysia (Sciara) coprophila</i>: A New/Old Emerging Model Organism

Susan  A. Gerbi

doi:10.3791/66751

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

생물학

Laboratoriumonderhoud van de onderste dipteravlieg Bradysia (Sciara) coprophila: een nieuw/oud opkomend modelorganisme

Published: April 19, 2024

doi:

10.3791/66751

Susan A. Gerbi

¹Department of Molecular and Cell Biology and Biochemistry, Division of Biology and Medicine,Brown University

Summary

Dit artikel schetst het laboratoriumonderhoud (inclusief paring en voeding) van de onderste dipteranvlieg Bradysia (Sciara) coprophila.

Abstract

Laboratoriumvoorraden van de onderste dipteravlieg, Bradysia (Sciara) coprophila, worden al meer dan een eeuw in stand gehouden. Protocollen voor laboratoriumonderhoud van B. coprophila worden hier gepresenteerd. Deze protocollen zullen nuttig zijn voor het snel toenemende aantal laboratoria dat B. coprophila bestudeert om te profiteren van zijn unieke biologische kenmerken, waaronder (1) een monopolaire spoel bij mannelijke meiose I; (2) non-disjunctie van de X-dyade in mannelijke meiose II; (3) chromosoominprenting om maternale en vaderlijke homologen te onderscheiden; (4) kiembaan-beperkte (L) chromosomen; (5) chromosoomeliminatie (vaderlijke chromosomen in mannelijke meiose I; één tot twee X-chromosomen in vroege embryo’s; L-chromosomen van de soma in vroege embryo’s); (6) geslachtsbepaling door de moeder (er is geen Y-chromosoom); en (7) ontwikkelingsgereguleerde DNA-amplificatie op de DNA-puff-loci in polyteenchromosomen van de speekselklier van larven.

Het is nu mogelijk om deze vele unieke kenmerken van chromosoommechanica te verkennen door gebruik te maken van de recente ontwikkelingen in sequencing en assemblage van het B. coprophila-genoom en de ontwikkeling van transformatiemethodologie voor genomische engineering. De groeiende wetenschappelijke gemeenschap die B. coprophila gebruikt voor onderzoek zal profiteren van de protocollen die hier worden beschreven voor het paren van de vliegen (fenotypische markers voor moeders die alleen zonen of enige dochters zullen hebben; details van massale paring voor biochemische experimenten), het controleren van het uitkomen van embryo’s, het voeden van larven en andere opmerkingen over het grootbrengen ervan.

Introduction

Een volledig begrip van biologische principes vereist de studie van vele verschillende organismen die de Boom des Levens overspannen. Hoewel tot het einde van de^19e eeuw een breed scala aan organismen werd beschreven, werden experimentele studies tegen het midden van de 20e^{eeuw beperkt} tot een handvol van minder dan een dozijn modelorganismen. Met de komst van het genomische tijdperk en het doel om genomen van alle soorten in de Tree of Life¹ te sequencen, zijn we nu in staat om de soorten organismen die voor laboratoriumexperimenten worden gebruikt uit te breiden en het voordeel te plukken van hun diversiteit. Een dergelijke uitbreiding van opkomende modelorganismen voor experimenten heeft een voorwaarde om ze in het laboratorium te kunnen behouden. Hier worden protocollen beschreven voor het kweken van zo’n opkomend nieuw/oud modelorganisme.

Het grootste deel van het dierenleven op aarde wordt veroorzaakt door vier superstralingen van insecten². Binnen de insecten zijn er ongeveer 158.000 soorten Diptera (echte vliegen)³, met ongeveer 3000 soorten in de familie Sciaridae (zwarte rouwvliegjes)⁴. De fruitvlieg Drosophila is de meest grondig bestudeerde van de Dipteran-vliegen. De lagere Dipteran-vlieg (Nematocera), Bradysia (voorheen Sciara genoemd) coprophila, divergeerde 200 miljoen jaar geleden van Drosophila, een “hogere Dipteran” -vlieg (Brachycera). Daarom bevindt B. coprophila zich in een gunstige taxonomische positie voor vergelijkende studies met D. melanogaster (Figuur 1). Bovendien heeft B. coprophila veel unieke biologische kenmerken die op zichzelf al het bestuderen waard zijn ^5,6,7. Veel van deze kenmerken zijn ongehoorzaam aan de regel van DNA-constantheid waarin alle cellen van een organisme dezelfde DNA-inhoud hebben. In B. coprophila, (i) wordt het vaderlijke genoom geëlimineerd op een monopolaire spoel in mannelijke meiose I; (ii) er is non-disjunctie van de X-dyade bij mannelijke meiose II; (iii) kiembaanbeperkte (L) chromosomen worden geëlimineerd uit de soma; en (iv) een of twee X-chromosomen worden geëlimineerd in het vroege embryo, afhankelijk van het geslacht van het individu. Chromosoominprenting om maternale van vaderlijke homologen te onderscheiden, werd voor het eerst ontdekt in B. coprophila en speelt een rol bij veel van deze chromosoomeliminatiegebeurtenissen. Naast chromosoomeliminatie vindt een andere bypass van DNA-constantheid plaats via ontwikkelingsgereguleerde, locusspecifieke DNA-amplificatie op de DNA-puff-loci in de polyteenchromosomen van de larvale speekselklier. Studies naar deze unieke kenmerken vereisen laboratoriumonderhoud van B.coprophila; Details van de veehouderij worden hier gepresenteerd om dergelijke studies te vergemakkelijken.

Figuur 1: Fylogenie van Bradysia (Sciara) coprophila. Populaire modelorganismen worden aangegeven in een blauw lettertype en hun taxonomische volgorde in een rood lettertype. Bradysia en andere Sciarid-rouwmuggen en muggen zijn lagere diptera-vliegen (voorheen onderorde Nematocera), terwijl Drosophila-soorten hogere dipteran-vliegen zijn (onderorde: Brachysera). Informatie aan de linkerkant van de figuur is afkomstig van Misof et ^al.33; informatie aan de rechterkant is afkomstig van Bertone et ^al.34 en Wiegmann et ^al.2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Voorheen had het geslacht Sciara het grootste aantal (700) soorten voor een eukaryoot, wat Steffan ertoe aanzette ze onder te verdelen⁸. Vervolgens stelde Shin voor om de familie Sciaridae onder te verdelen in de onderfamilie Sciarinae (met zes geslachten, waaronder Sciara, Trichosia en Leptosciarella), de onderfamilie Megalosphyinae (inclusief het geslacht Bradysia) en drie andere groepen (waaronder Pseudolycoriella)⁹. De fylogenie van de Sciaridae is de laatste jaren door verschillende groepen verder bestudeerd ^9,10,11. In de afgelopen decennia zijn de namen van veel organismen in de familie Sciaridae veranderd¹². Hoewel de meeste literatuur van meer dan een eeuw verwijst naar het organisme dat we bestuderen als Sciara coprophila, is de huidige taxonomische naam nu Bradysia coprophila (syn. Bradysia tilicola en andere synoniemen)¹⁰. Ze komen wereldwijd voor en zijn algemeen bekend als rouwvliegjes omdat ze paddenstoelen en andere schimmels eten. Ze werden voor het eerst beschreven in 1804 door Meigen¹³ in Europa en vervolgens door Johannsen^14,15 in Noord-Amerika. B. coprophila werd verzameld in het Cold Spring Harbor Laboratory en laboratoriumvoorraden werden opgericht door Charles Metz in de vroege jaren 1900 toen hij een afgestudeerde student was aan de Columbia University bij Thomas Hunt Morgan. De huidige voorraden weerspiegelen dus een eeuw van inteelt. Evenzo werd de biologie van B. coprophila verder opgehelderd door tientallen jaren van cytogenetische studies door Helen Crouse (die haar Ph.D. werk met Barbara McClintock).

In de jaren 1930 concurreerde Bradysia (Sciara) met Drosophila melanogaster als modelsysteem voor genetische studies. Ondanks de vele unieke biologische kenmerken werd B. coprophila overschaduwd door D. melanogaster als een populair modelorganisme, omdat door straling geïnduceerde fenotypische mutaties nodig waren voor genetische studies en gemakkelijker te bereiken waren in de laatste, ook al is B. coprophila slechts iets resistenter tegen gammastraling dan D. melanogaster¹⁶. In het moderne tijdperk van genomica is dit niet langer een probleem. Aangezien de genoomsequentie 17,18,19 (Urban, Gerbi en Spradling, gegevens niet getoond ) en methoden voor transformatie^20,21 (Yamamoto en Gerbi, gegevens niet getoond) voor B. coprophila onlangs beschikbaar zijn gekomen, is de tijd nu rijp om het te gebruiken als een nieuw/oud opkomend modelsysteem, zoals gezien door de groeiende gemeenschap van wetenschappers die het voor hun onderzoek hebben aangenomen. In dit artikel worden de procedures voor het laboratoriumonderhoud beschreven.

B. coprophila mist een Y-chromosoom en het geslacht van de nakomelingen wordt bepaald door de moeder. Vrouwen met het X’-chromosoom (“X-prime”) met een lange paracentrische inversie zullen alleen dochters hebben, terwijl vrouwen die homozygoot zijn voor het standaard (niet-omgekeerde) X-chromosoom alleen zonen⁵ zullen hebben (Figuur 2). Sequentie-informatie is beschikbaar voor het X-chromosoom¹⁹, maar het moleculaire mechanisme moet nog worden opgehelderd over hoe het X-chromosoom bepaalt dat nakomelingen vrouwtjes zullen zijn. Mannetjes hebben nooit het X’-chromosoom en na de bevruchting zijn vrouwtjes X’X (heterozygoot voor de X’) of XX. Volwassen X’X-vrouwtjes kunnen worden onderscheiden van XX-vrouwtjes door fenotypische markers op de vleugel (Figuur 3). X’X vrouwtjes (die alleen dochters zullen krijgen) zijn te herkennen aan de dominante Wavy (W) vleugelmarkering op de X’ (zoals in de HoLo2 stam)²². Als alternatief kunnen XX vrouwtjes (die alleen zonen zullen hebben) worden herkend aan de recessieve petite (p) vleugelmarkering op de X zoals bij de 91S voorraad²³. In dit geval hebben X’Xp vrouwtjes vleugels over de volledige lengte (niet kleine) vleugels en hebben ze alleen dochters. De standaard 6980 draagt een recessieve marker op het X-chromosoom voor gezwollen (sw) aders²⁴, evenals de dominante marker Wavy op de X’, waardoor twee markers kunnen worden geselecteerd voor kruisingen. De mate van expressie van Wavy kan variëren en lijkt zwakker in overvolle flesjes waar het voedsel beperkt is of als de temperatuur te warm wordt. Het fenotype van de golvende vleugel is uitzonderlijk sterk als de larven in de koelcel (4°-8 °C) worden gehouden in plaats van de gebruikelijke 21 °C. Hoewel de recessieve petite wing marker niet variabel is en zeer gemakkelijk te identificeren is, worden 91S-kolven minder vaak gebruikt omdat ze minder gezond zijn dan de HoLo2-kolf. De paringsschema’s van B. coprophila worden hier gepresenteerd (Figuur 2) en in detail beschreven voor de HoLo2-, 7298- en W14-bestanden (Supplemental File 1), de 91S-bestanden (Supplemental File 1), de 6980-bestanden (Supplemental File 1) en de translocatie-bestanden (Supplemental File 1). De translocatievoorraden bestaan niet meer; het waren wederzijdse translocaties van heterochromomeren (H1, H2 en H3) op de korte arm van de X die de ribosomale RNA-genen 25,26,27 bevat.

Figuur 2: Paringsschema voor B. coprophila. Dit organisme heeft geen Y-chromosoom (de mannelijke soma heeft een enkele X); Moeders bepalen het geslacht van hun kroost. XX moeders hebben alleen zonen en X’X vrouwen hebben alleen dochters. Het X’-chromosoom heeft een lange paracentrische inversie in vergelijking met het X-chromosoom. De vaderlijke of moederlijke afstamming van het X-chromosoom (of X’) wordt in deze figuur respectievelijk blauw of rood aangeduid. Sperma is haploïde voor de autosomen, maar heeft twee kopieën van het X-chromosoom vanwege non-disjunctie in meiose II. De somatische afstamming van vroege embryo’s elimineert een of twee kopieën van de vaderlijk afgeleide X als ze respectievelijk vrouwelijk of mannelijk zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Vleugelfenotypes van B. coprophila. Volwassen vrouwtjesvliegen worden getoond met verschillende vleugelfenotypen: (A) rechte vleugel (XX), (B) golvende vleugel (_X’WX), (C) extreem golvende vleugel (_X’WX) fenotype dat verschrompeld uiterlijk heeft na opslag van larven in de koude room, (D) kleine vleugel (XpXp) die rudimentair is, (E) rechte vleugel met wildtype (XX) en niet gezwollen aders, (F) rechte vleugel met gezwollen aders (XswXsw) waarbij kleine belletjes (zwarte pijlen) verschijnen aan de bovenrand van de vleugel en/of bij de punt van beide vleugels, (G) extreem voorbeeld van gezwollen waarbij een blaar (witte pijl) voorkomt op één of beide vleugels. Mannetjes missen het X’-chromosoom en zullen daarom nooit golvende vleugels hebben, maar ze hebben kleine of gezwollen vleugels in respectievelijk de 91S-voorraad of de 6980-voorraad. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het doel bij voorraadonderhoud is om kruisingen uit te voeren waarbij de helft van de kruisen afkomstig is van vrouwelijke moeders en de helft van de kruisingen van mannelijke producerende moeders om gelijke aantallen vrouwelijke en mannelijke volwassenen in de volgende generatie te hebben voor volgende kruisingen. Dit houdt echter ook planning in, aangezien de levenscyclus voor mannetjes korter is dan voor vrouwtjes en volwassen mannetjes tot een week voor volwassen vrouwtjes verschijnen. De natuur past zich aan deze asynchronie tussen de geslachten aan door de mannelijke embryo’s als larven te laten verschijnen 1-2 dagen na de vrouwelijke larven uit een kruising op dezelfde datum. Om er echter voor te zorgen dat mannelijke en vrouwelijke adulte dieren tegelijkertijd beschikbaar zijn voor laboratoriumkruisingen, kan de ontwikkeling van vrouwtjes enigszins worden versneld door flesjes met vrouwelijke larven bij kamertemperatuur te laten staan in plaats van bij 21 °C of door flesjes met mannelijke larven bij iets koelere temperaturen (bijv. 16 °C) te plaatsen. Een andere route die meer onfeilbaar is, is om op maandag kruisingen te maken met moeders die vrouwen produceren en kruisingen met moeders die mannelijk produceren op vrijdag van dezelfde week. De gemakkelijkste route, en dat is wat we gebruiken, is om elke week op dezelfde dag kruisingen uit te voeren met moeders die vrouw en moeder produceren, en op die dag in elke opeenvolgende week kruisingen uit te voeren. In die benadering kunnen volwassen vrouwtjes uit een kruising in week 1 worden gedekt met volwassen mannetjes die in week 2 uit een kruising zijn gekomen.

De levenscyclus van vrouwelijke B. coprophila is 5 weken bij een opfok bij 21 °C (tabel 1). De lengte van hun levenscyclus is iets langer bij koelere temperaturen of als ze ondervoed zijn. De levenscyclus van mannelijke B. coprophila is ~4-4,5 weken sinds ze 0,5-1 week voor vrouwtjes verpoppen. Het einde van elke larvale instar wordt gemarkeerd door het afstoten van de nagelriem, die wordt veroorzaakt door een uitbarsting in het niveau van het steroïde hormoon ecdyson. In tegenstelling tot D. melanogaster, die drie larvale instars heeft, heeft B. coprophila vier larvale instars.

Ontwikkelingsfase	Dagen na de dekking (dpm)	Duur van de etappe (dagen)
Gelegd ei	1-2
Embryo	1-2 tot 7-8	~7 dagen
Larve
Larvale instars 1, 2 en 3	7-8 tot 16-19	~10
4e larve instar pre-oogvlek	16-19 tot 21-24	5
4e larvale instar oogvlekkenstadium	21-24 tot 25-28	4
Pop	25-28 tot 30-33	5
Volwassene	leeft 1-2 dagen bij 21 °C als ze gepaard worden of leeft 2-3 weken bij 16 °C als ze niet gepaard zijn.

Tabel 1: Levenscyclus van vrouwelijke B. coprophila bij 21 °C.

B. coprophila kan overal in het bereik van 15 °C-25 °C worden gehouden, waarbij de ontwikkeling langzamer verloopt bij lagere temperaturen. Dit insect geeft de voorkeur aan een vochtige omgeving (te vinden in de grond van kamerplanten of champignonbedden), dus we bewaren een beker met gedeïoniseerd water in de broedmachine. B. coprophila kan op kamertemperatuur worden bewaard in een metalen brooddoos met een loszittend deksel en een beker water, maar ze gaan in een hitteschok bij 37 °C²⁸, wat een gevaar is in warme klimaten. Michael Ashburner en anderen hebben met weinig succes geprobeerd om D. melanogaster in de kou te bewaren om de tijd die nodig is voor het bijhouden van de voorraad te verkorten. Een groot voordeel van B. coprophila daarentegen is dat flacons met larven in het middenstadium tot 3 maanden kunnen worden bewaard op een open plank in de koelcel (4-8 °C) met minimale zorg van slechts één keer per maand voeren. Ze ontwikkelen zich in de kou uiterst langzaam tot aan het popstadium en zullen als vruchtbare volwassenen tevoorschijn komen wanneer de flesjes worden teruggebracht naar 21 °C. Vermoedelijk bootst dit hun overwintering in het wild na. Deze door kou veroorzaakte ontwikkelingsstagnering kan vergelijkbaar zijn met die welke wordt waargenomen na gammabestraling van B. coprophila-larven ¹⁶ in het middenstadium, maar ontwikkelingsstagnering wordt niet gezien bij larven in een laat stadium die het point of no return voor hun normale ontwikkelingsprogressie zijn gepasseerd.

Protocol

De hier beschreven protocollen vertegenwoordigen een eeuw ervaring van de Bradysia (Sciara) voorraadcentra onder toezicht van Charles Metz, Helen Crouse en Susan Gerbi, evenals input van anderen. 1. Paring kruisen Gebruik één volwassen vrouwtje en twee volwassen mannetjes per glazen injectieflacon met een diameter van 28 mm. Zodra 100% succes is bereikt bij het herkennen van vleugelfenotypes voor moeders die alleen dochters of zonen zullen krijgen, gebruik dan twee vrouwtjes en twee mannetjes per injectieflacon om het aantal larven/flacon te verhogen. Voeg vrouwtjes toe aan elke injectieflacon voordat u de mannetjes toevoegt die sneller wakker worden uit de anesthesie dan de vrouwtjes.OPMERKING: De onderstaande beschrijving gaat ervan uit dat u CO2 heeft; Als alternatief kan ether worden gebruikt om de volwassen vliegen te verdoven. Als u ether gebruikt om de volwassen vliegen te verdoven, plak dan een blok met gevouwen laboratoriumdoekjes (bijv. kimwipes) aan de binnenkant van een rond glazen deksel van een Coplin-pot en gebruik een druppelaar om wat ether uit de fles over te brengen om het laboratoriumdoekje te bevochtigen (maar niet verzadigd en zo nat dat ethervloeistof eraf valt en het risico loopt de vliegen te verdrinken). Plaats voor stap 1.6 hieronder het bevochtigde etherkussen gedurende ~1 minuut op de geopende injectieflacon totdat de volwassenen stoppen met bewegen. Zodra de volwassenen zijn overgebracht naar een witte keramische tegelplaat (gebruikt in plaats van het witte vliegenkussen), houdt u periodiek (wanneer de poten van de vliegen beginnen te trillen) het kussen dat vers met ether is bevochtigd over de vliegen (niet aanrakend) op de plaat gedurende ~1 min.LET OP: Ether is ontvlambaar en moet worden bewaard in een afzuigkap en niet in de koelkast. Plaats binnen handbereik een dienblad met flesjes met volwassen vrouwtjes, een bakje met volwassen mannetjes en een bakje met lege flesjes met 2,2% (wt/vol) agar. Plaats op de laboratoriumbank briefjes met de vermelding “vrouw” of “mannelijk” en het vleugelfenotype van de moeder, zodat de flacon met volwassenen die voor het kruis zijn geselecteerd, in de juiste groep wordt geplaatst, waar alle flacons in de ene groep alleen mannelijke nakomelingen zullen hebben en alle flacons in de andere groep alleen vrouwelijk nageslacht.OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen condensdruppels in de injectieflacon zitten, aangezien de volwassenen aan de druppels blijven kleven. Als de injectieflacons in een plastic doos zijn bewaard, zet de injectieflacons dan ten minste 1 uur voor gebruik op een laboratoriumtafel bij kamertemperatuur om de condensatie te laten verdampen. Zet het CO2 -gas en de lamp voor de ontleedmicroscoop aan.OPMERKING: Een lichtbron met glasvezel heeft de voorkeur omdat deze minder warmte afgeeft, waardoor de verdoofde vliegen sneller wakker worden. Tik krachtig met volwassenen op de injectieflacon op een rubberen kussentje zodat de volwassenen op de bodem van de injectieflacon vallen en verwijder de plug; plaats het mondstuk van het CO2 -pistool en voeg de plug weer toe. Druk de trekker van het mondstuk in zodat CO2 gedurende ~1 minuut in de injectieflacon stroomt om de volwassenen te verdoven. Zet een voet op het voetpedaal zodat CO2 op het witte vliegenkussen stroomt in plaats van op het pistoolmondstuk. Houd het voetpedaal de hele tijd ingedrukt dat vliegen zich op het witte vliegenkussen bevinden (of anders met tussenpozen het voetpedaal indrukken wanneer de benen van de vliegen beginnen te trillen). Verwijder het mondstuk en de plug van de injectieflacon en keer de injectieflacon om over een wit vliegenkussen onder een ontleedmicroscoop. Tik met de onderkant van de omgekeerde flacon tegen de microscoop zodat de volwassenen uit de flacon op het witte vliegenkussen vallen. Selecteer de dikste volwassenen (onlangs omsloten met witte buik) en gebruik een pincet met fijne punt om de volwassene voorzichtig bij zijn midden- of achterpoot op te pakken. Verwond de voorpoten die worden gebruikt voor de paringsdans niet. Gebruik geen volwassenen die net zijn ingesloten en waarvan het lichaam volledig wit is en nog niet zwart is geworden, omdat hun vleugels kort en nog niet volledig ontwikkeld zullen zijn, zodat het vleugelfenotype niet kan worden gescoord. Volwassenen met een slankere buik kunnen nog steeds worden gebruikt, hoewel ze een verminderde vruchtbaarheid hebben. Gebruik geen magere volwassenen waarvan de vleugels verticaal van hun lichaam zijn geheven, aangezien ze dood zijn. Verwijder met de andere hand de plug uit de injectieflacon met 2,2% (gew./vol) agar. Met de hand die de tang vasthoudt met de volwassene, tikt u de tang krachtig tegen de bovenste binnenwand van de injectieflacon, zodat de volwassene op de bodem van de injectieflacon valt. Plaats de plug terug in de injectieflacon. Herhaal stap 1.5-1.11 hierboven om elke injectieflacon met vrouwelijke volwassenen in te stellen. Gebruik een penseel om de ongebruikte vliegen van het witte vliegenkussen terug in hun ouderflacon te vegen. Zet een vinkje op het etiket van de ouderflacon om aan te geven dat deze is gebruikt voor het paren (hoewel deze indien nodig opnieuw kan worden gebruikt). Plaats voor routinematig voorraadonderhoud 6-8 injectieflacons met moeders die vrouwen produceren en 6-8 injectieflacons met moeders die mannen produceren (Figuur 4). Plaats de helft van de injectieflacons met moeders (of vaders) uit de ene flacon voor volwassenen en de andere helft van de nieuwe flacons met behulp van een andere flacon voor volwassenen om genetische knelpunten te minimaliseren.Af en toe zal een mis-segregatie-gebeurtenis een uitzonderlijke mannelijke in vrouwelijk producerende flesjes opleveren. Als een flacon met volwassen vrouwtjes een uitzonderlijk mannetje heeft, verwijder het dan en knijp het om dat mannetje te doden. Gooi indien mogelijk alle vrouwtjes uit die injectieflacon weg en wacht een paar dagen tot er meer volwassen vrouwtjes in de buurt komen en veilig kunnen worden gebruikt voor kruisingen.OPMERKING: Het verdient de voorkeur om de vrouwtjes in die flacon niet te gebruiken voor kruisingen, omdat ze mogelijk hebben gepaard met het uitzonderlijke mannetje en geen vruchtbare kruising produceren. Zodra de volwassen vrouwtjes aan alle flesjes zijn toegevoegd, herhaalt u stap 1.5-1.11 om twee volwassen mannetjes (Figuur 4) toe te voegen aan elke injectieflacon die al vrouwelijke vliegen bevat. Tik op de flacon met vrouwtjes op een rubberen kussentje zodat ze niet ontsnappen als de twee mannetjes achtereenvolgens worden toegevoegd.OPMERKING: Werk snel en verdoven de volwassen vliegen niet te veel, want dan gaan ze dood. Voeg een etiket toe aan elke injectieflacon met de voorraad, het kruis (voor vrouwelijke of mannelijke nakomelingen), of de moeder afkomstig is van volwassen flacon #1 of #2 en de datum van paring. Voer ook de bovenstaande informatie in een notitieboekje in en vermeld het aantal flesjes dat voor elk kruis is opgesteld.OPMERKING: Het is handig om een papieren handdoek toe te voegen om de mannelijk producerende injectieflacons te scheiden van de vrouwelijk producerende flesjes in de lade. Laat de flesjes ~15 minuten ongestoord op het aanrecht staan om er zeker van te zijn dat de volwassenen wakker worden en rondvliegen. Observeer of ze paren (heel snel nadat ze wakker zijn geworden) waarbij het vrouwtje en het mannetje naar achteren gericht zijn (de mannetje grijpt de puntige legboor van het vrouwtje) (Figuur 4, onder).OPMERKING: Een volwassen vrouwtje accepteert een volwassen mannetje slechts één keer, dus verdringt de flesjes niet na het paren, omdat dit het mannetje van het vrouwtje kan scheiden tijdens het paren en dat vrouwtje zal niet opnieuw paren. Plaats de bak met gekoppelde injectieflacons in de broedmachine (bijv. 21 °C). Label de tray met de naam van de bouillon (bijv. HoLo2) en de week van de cyclus van 5 weken (week 1, 2, 3, 4 of 5).NOTITIE: Bewaar de bak met net gepaarde vliegen in een apart deel van de broedmachine of een andere broedmachine als herinnering om de flesjes niet te voeren totdat de larven zijn opgekomen (hieronder beschreven). 2. Massale paring OPMERKING: Doorgaans heeft een alleenstaande B. coprophila-moeder 60 nakomelingen in haar kroost. Wanneer een groter aantal nakomelingen nodig is voor experimenten, kan een massale paring worden gedaan in plaats van de hierboven beschreven paring met één paar. De massaparing kan worden gedaan in de standaard glazen flesjes met een diameter van 28 cm, wanneer de moeders een dag later worden verzameld voor geïnduceerde eierlegging en embryoverzameling. Als er echter een groter aantal larven nodig is, gebeurt de massale paring in een pot met een groter oppervlak om overbevolking te voorkomen. Prik verschillende kleine gaatjes in het deksel van de pot zodat de larven wat lucht kunnen krijgen. Volg de bovenstaande stappen in sectie 1, maar gebruik een pincet met een fijne punt om alle moeders die vrouwen produceren (of alle moeders die mannen produceren) naar een voorste hoek van het witte vliegenkussen te verplaatsen. Gebruik 10-15 verdoofde dikke volwassen vrouwtjes en veeg deze groep met een penseel in de flacon of pot met kleine gaatjes in het deksel.OPMERKING: Voer stap 2.1 en 2.2 uit. snel voor massale paring om overanesthesie te voorkomen die vruchtbare kruisingen zou voorkomen. Selecteer 20-25 verdoofde dikke volwassen mannetjes en verplaats ze met een pincet met fijne punt naar de voorste hoek van het witte vliegenkussen. Tik krachtig op de flacon of pot met de vrouwtjes op een rubberen kussentje, zodat ze niet ontsnappen wanneer de plug of het deksel wordt verwijderd om de verdoofde cluster van volwassen mannetjes met een penseel van het witte vliegenkussen te vegen. 3. Embryoverzameling na massale paring Voer een dag (24 uur) na de paring stap 1.5-1.11 uit om de volwassen vliegen (mengsel van vrouwtjes en mannetjes) te verdoven en ze over te brengen naar een wit vliegenpad.OPMERKING: De oögenese is nog niet voltooid wanneer de volwassen vliegen paren, wat leidt tot het beëindigen van de meiose; De rijpe eieren worden bevrucht door sperma dat in de spermatheca is opgeslagen wanneer de eieren worden afgevoerd 29. Voltooiing van de oögenese kan 1-2 dagen duren, daarom is na de paring 1 dag toegestaan voordat het leggen van eieren wordt geïnduceerd. Pak met een pincet met fijne punt een volwassen vrouwtje bij haar vleugels en plaats haar op een petrischaaltje met een diameter van 100 mm dat 2,2% (wt/vol) agar bevat, met haar vleugels in de agar. Herhaal deze stap achtereenvolgens voor elk volwassen vrouwtje op het witte vliegenkussen. Gooi de volwassen mannetjes weg op het schutplatform. Zodra alle vrouwelijke vliegen op de agar zijn gespietst, induceert u het leggen van eieren door voorzichtig met een tang in de kop te knijpen totdat de vrouwelijke vlieg epileptische bewegingen heeft. U kunt ook zachtjes in haar borstkas knijpen. Ze zal dan binnen 30-60 minuten een cluster van bevruchte eieren leggen. Dek de petrischaal af met het deksel dat is bevochtigd met een met water bevochtigd laboratoriumdoekje om elektrostatische aantrekkingskracht van de eieren op het deksel te voorkomen. 4. Controle van het “luik” van larven Controleer 1 week na het paren op “uitkomen” van larven; Verwijder de plug uit de injectieflacon en gebruik een ontleedmicroscoop om te scoren op larven. Hun zwarte kaak zal herhaaldelijk openen en sluiten en ze zullen langzaam naar voren bewegen. Als er maar een paar larven zijn, schrijf dan “weinig” op het etiket van de injectieflacon, als herinnering om die flacon minder te voeren. Onderzoek elke flacon in de lade met dat kruis en voer het aantal flacons met larven in het notitieboekje in een kolom in naast het aantal flacons dat in die paring is opgesteld.OPMERKING: Diepgele eieren zullen zich niet ontwikkelen. Witte eieren zullen zich waarschijnlijk ontwikkelen en 1 dag voordat de larven tevoorschijn komen, zal zich zwart pigment (de toekomstige kaak) ontwikkelen aan het voorste uiteinde van het ei. Verwar schimmel niet met een wit filament dat eindigt in een zwarte bol aan het uiteinde voor larven – de schimmel zal niet bewegen, in tegenstelling tot de larven die naar voren kruipen op de agar. Voeg een klein beetje stro (slechts één keer) toe aan elke injectieflacon met larven om de overtollige vochtigheid onder controle te houden en een schuilplaats voor de larven te bieden. Verplaats de bak naar de broedmachine (bijv. 21 °C) met trays met larven van de paringskruisen van de voorgaande weken en begin de flesjes te voeden met pas opgekomen larven (zie het onderstaande gedeelte over voeding).OPMERKING: Over het algemeen zullen de larven zich in een cluster in de buurt van hun dode moeder bevinden en zullen ze haar beginnen op te eten; Vermoedelijk wordt hierdoor de gist overgebracht van de darm van de moeder naar de darm van de larven. U kunt beginnen met voeren op de dag dat de larven uitkomen of binnen 2 dagen daarna. LET OP: Als de voeding wordt uitgesteld, eten de larven elkaar op, waarbij er nog maar één vetlarve per injectieflacon overblijft! Ga door met het controleren van injectieflacons die nog geen larven hadden gedurende 3 dagen per week. Als er na 7-10 dagen geen larven zijn opgekomen, gooi de injectieflacon dan weg of bewaar deze voor het wassen van de injectieflacon. 5. Het eten maken OPMERKING: Alle voedselingrediënten moeten vrij zijn van pesticiden! Gebruik een eetlepel om de volgende ingrediënten op volume af te meten en doe ze in een metalen of glazen pan (bijv. een metalen bakvorm van 8 inch x 8 inch): 4 delen haverstro (8 el), 2 delen Shitake-paddenstoelenpoeder (4 el), 1 deel spinaziepoeder (2 el), 1 deel brandnetelpoeder (2 el). Gebruik de eetlepel om de ingrediënten goed te mengen in de pan.OPMERKING: Als alternatief kunnen 2 delen alleen spinaziepoeder of alleen brandnetelpoeder worden gebruikt in plaats van 1 deel van elk. Dek de pan af met aluminiumfolie en autoclaaf op een droogcyclus gedurende 20-30 min. Laat het een nacht of langer afkoelen tot kamertemperatuur. Verwijder de folie van de pan en breek het aangekoekte gesteriliseerde voedselmengsel, gebruik een malende beweging met de eetlepel om een poederachtig mengsel te creëren. Voeg 1 deel (2 volle eetlepels) biergist toe en meng goed door het geautoclaveerde voedselmengsel.OPMERKING: De biergist wordt niet geautoclaveerd, omdat dat de gist zou doden. Breng het voedselmengsel over in een steriele pot met dop.OPMERKING: Hetzelfde type pot van 240 ml als gebruikt voor massaparing kan worden gebruikt, en het bovenstaande recept zal de pot vullen. Evenzo moet hetzelfde type gesteriliseerde pot met dop worden gevuld met alleen stro dat is geautoclaveerd in een met folie bedekte pan. 6. Voeding OPMERKING: Pas de hoeveelheid gegeven voedsel aan op basis van de leeftijd en de hoeveelheid larven. Geef veel voer aan potjes met veel larven van een massale paring. Geef slechts een klein beetje voedsel aan petriborden met larven die een paar dagen worden bewaard voor ontwikkelingsstadiëring. De hieronder beschreven voedingsmethode is ontwikkeld in het laboratorium van Charles Metz 29 en wordt al een eeuw lang met succes gebruikt door zijn laboratorium en door Helen Crouse, Susan Gerbi en anderen. Handen wassen en goed afspoelen om zeep te verwijderen.OPMERKING: Handschoenen worden niet aanbevolen, omdat ze het gevoel van uw vingers verminderen voor het regelen van de hoeveelheid voedsel die aan elke injectieflacon wordt gegeven. Bewaar een steriele pot met gemalen stro en een steriele pot met voedsel in de incubator (bijv. 21 °C) waar de larven worden bewaard. Verwijder het deksel van de pot en giet wat voedsel in een schone kom (bijv. een snoepschaaltje) voor gemakkelijkere toegang; Plaats het deksel terug op de pot met het resterende voedsel. Bewaar de open kom met voedsel in een metalen of glazen bakje; Dit voorkomt dat mijten of andere insecten over de wand van de bak kruipen om de kom met voedsel binnen te dringen. Pak wat voedsel op tussen de tweede en derde vinger (of tussen duim en tweede vinger). Haal met de andere hand een injectieflacon uit de lade en verwijder de plug, terwijl u deze tijdens het voeden met de vingers vasthoudt. Onderzoek de injectieflacon op de leeftijd en het aantal larven en doe de juiste hoeveelheid voedsel in de injectieflacon door de twee vingers die het voedsel vasthouden tegen elkaar te draaien. Flesjes met pas opgekomen larven hebben slechts een paar korrels voedsel nodig. Injectieflacons met oudere larven moeten een dunne laag voedsel hebben die de bovenkant van de agar bedekt. Als er witte schimmel in de injectieflacon zit, gebruik dan 70% ethanol gespoten op een laboratoriumdoekje om een lange metalen sonde schoon te vegen (bijv. met een houten handvat), verwijder de plug en steek de schone sonde in de injectieflacon om de mal op het oppervlak van de agar af te tikken. Als er veel schimmel is, draai dan de sonde rond om de mal om de sonde te wikkelen om deze uit de injectieflacon te verwijderen. Verstoor de bovenkant van de agar niet, want daar leven larven; Voeg slechts een kleine hoeveelheid voedsel toe en plaats de plug terug in de injectieflacon. Veeg de sonde schoon met een laboratoriumdoekje dat is bevochtigd met 70% ethanol voordat u de sonde opbergt of gebruikt om een andere injectieflacon schoon te maken. Zodra alle injectieflacons in een tray zijn ingevoerd, plaatst u de tray terug in de broedmachine en verwijdert u de volgende tray voor het voeden zoals in stap 6.3. Nadat het voeren is voltooid, giet u het resterende voedsel uit de kom in de eerder gesteriliseerde pot, sluit u de pot af en bewaart u deze in de couveuse. 7. Verzameling van larven of poppen op petriplaten Gebruik voor kleine aantallen larven een metalen sonde of spatel die is afgeveegd met 70% ethanol om in de bovenste laag agar in een injectieflacon te graven om de aanhangende agar met enkele larven over te brengen naar een steriele petrischaal met een diameter van 100 mm die voor de helft gevuld is met 2,2% (gew./vol) agar. Voor grotere aantallen larven steekt u een spatel langs de wand aan de onderkant van de injectieflacon om de agarplug uit de injectieflacon te halen en plaatst u deze met de voorkant naar boven in een lege petrischaal. Gebruik een ontleedmicroscoop om de larven aan de bovenkant van de agarprop te vinden en breng ze met een fijngepunte pincet over naar een steriele petrischaal met een diameter van 100 mm die half gevuld is met 2,2% (gew./vol) agar. Gebruik een ontleedmicroscoop om de larven met een fijngepunte tang te sorteren in groepen van hetzelfde ontwikkelingsstadium.OPMERKING: Vanwege een lichte ontwikkelingsasynchronie zullen er verschillende clusters van gesorteerde larven op de petriplaat zijn met 2,2% (wt/vol) agar. Voeg een klein snufje voedsel toe en plaats het petrischaaltje met larven in de broedmachine. Verwijder het dagelijks voor observatie met de ontleedmicroscoop voor selectie van het gewenste ontwikkelingsstadium.OPMERKING: Voor DNA-bladerdeegstudies doorlopen vroege oogvlekkenlarven de stadia van 10×5, 12×6, 14×7 en rand oog/druppelkaak met ~1 dag in elk van deze stadia 30,31. Kies poppen waarvan de ogen 1/4 tot 1/2 gevuld zijn met pigment om meiose I- en II-stadia in de pop-teelballen te hebben. 8. Koelcel opslag van larven Bewaar als back-up in de koelruimte ongeveer vier injectieflacons met vrouwelijke larven en vier flacons met mannelijke larven van 2 opeenvolgende weken kruisingen. Voer voor de back-upopslag larven die vroeg 4e instar zijn (pre-oogvlekkenstadium) en zet ze in een open bak op een plank in de koelkamer; Voer deze injectieflacons slechts één keer per maand. Verwijder de 16 injectieflacons van de 2 opeenvolgende weken van paringskruisen na 2-3 maanden uit de kou (markeer dit op een kalender als herinnering); plaats ze in een couveuse (bijv. 21 °C) om ze normaal te voeden en laat ze zich ontwikkelen tot volwassenen om te gebruiken voor kruisen. Wanneer de flacons uit de koelcel worden gehaald, plaatst u een verse set flacons met larven uit het begin van de 4e instar in de koelruimte, zodat deze flacons altijd beschikbaar zijn als back-up voor voorraden.OPMERKING: De levensvatbaarheid na opslag in een koelcel is niet systematisch getest op verschillende ontwikkelingsstadia, maar onze ervaring leert dat koude opslag van larven uit het begin van de 4einstar goed werkt. 9. Wassen van injectieflacons Nadat de volwassenen zijn overleden (~2-3 weken na de eclosie), haalt u de injectieflacons uit de couveuse en plaatst u ze gedurende 1 uur op 60-70 °C om eventuele resterende organismen te doden. Verwijder de katoenen pluggen en bewaar ze in een plastic doos. Gebruik een spatel om de agarplug uit de injectieflacon in een afvalbak te schrapen. Week de injectieflacons een nacht of langer ondergedompeld in water in een pan. Gebruik een reageerbuisborstel die speciaal voor dit doel is bewaard (nooit gebruikt voor vaten met chemicaliën of met zeep) en schrob op en neer in de injectieflacon onder stromend kraanwater. Plaats de gereinigde injectieflacon met de open kant naar beneden in een metalen mand. Vul de mand met schoongemaakte injectieflacons.NOTITIE: Gebruik nooit zeep in de injectieflacons, aangezien zeepresten B. coprophila kunnen doden. Voeg een deksel van gaas toe aan de mand en terwijl u het deksel op zijn plaats houdt, keert u de mand om om alle injectieflacons met gedeïoniseerd water te vullen. Terwijl u het deksel nog steeds op zijn plaats houdt, keert u de mand om om het gedeïoniseerde water uit de injectieflacons te legen. Herhaal de spoelingen met gedeïoniseerd water 4x. Plaats de manden met gereinigde flesjes op keukenpapier of een open gaasplatform (bijv. laboratoriumwagen) om een nacht of langer te drogen. Bewaar de droge injectieflacons in een lade.OPMERKING: Laat flesjes met dode volwassenen niet te lang staan voordat u ze wast, omdat dit een mijtenplaag kan uitlokken. 10. Agar gieten Vul een grote container (metalen mand of metalen tray) met schone flacons en voeg een katoenen plug toe aan elke flacon. Hergebruik de pluggen die uit oude flacons zijn gehaald toen de flacons werden gewassen, en gebruik de pluggen herhaaldelijk totdat ze degraderen en uit elkaar vallen en moeten worden weggegooid. Steriliseer de container met de verstopte injectieflacons op een droge cyclus gedurende ~30 minuten en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur om ze in de autoclaafcontainer te bewaren. Houd altijd twee containers bij de hand (één actief in gebruik en één reserve) met geautoclaveerde verstopte flesjes. Doe 11,0 g agarpoeder in een erlenmeyer van 1 l en voeg 500 ml gedestilleerd water toe om een agaroplossing van 2,2% (gew/vol) te maken die voldoende is om ~24 injectieflacons (~21 ml/flacon) te gieten. Draai de kolf rond en plaats deze in een magnetron.NOTITIE: Gebruik vanaf hier een hittebestendige autoclaafhandschoen om de kolf te hanteren. Dezelfde 2,2% (wt/vol) agar-oplossing kan in petriplaten (voor geplukte larven) of potten (voor massaparingen) worden gegoten als deze nodig zijn. Magnetron gedurende 1 minuut, verwijder de kolf om hem rond te draaien, plaats hem terug in de magnetron en zet hem opnieuw 1 minuut in de magnetron. Herhaal dit meerdere keren. Bekijk de kolf door de glazen deur van de magnetron. Wanneer de agar-oplossing begint te schuimen en te koken, gebruik dan onmiddellijk de handmatige stopknop. Draai de kolf op dit punt niet rond (hij kan overkoken) en haal hem voorzichtig uit de oven naar het aanrecht en laat hem een paar minuten rusten. Verwijder de plug uit een gesteriliseerde injectieflacon en houd deze met één hand vast; Gebruik de andere hand om ~2,5 cm hoge 2,2% agar in de gesteriliseerde injectieflacon te gieten. Plaats vervolgens de plug terug in de injectieflacon. Herhaal dit totdat alle agar is gegoten.OPMERKING: Als er te weinig agar in de injectieflacon wordt gegoten, zal deze tijdens gebruik sneller opdrogen en wegkrimpen van de wanden van de injectieflacon. Als er te veel agar in de flacon wordt gegoten, is het moeilijk om scherp te stellen op de bovenste laag bij het insnijden van het “babyluik” van larven met een ontleedmicroscoop. Laat de gegoten flesjes 1-2 dagen op kamertemperatuur op het aanrecht staan, zodat de agar hard wordt en het vocht volledig verdampt. Gebruik de injectieflacons voor het paren van kruisen of bewaar ze liggend op hun zij in een plastic doos met een goed sluitend deksel; Leg een met water bevochtigde papieren handdoek op de injectieflacons voordat u het deksel op de doos plaatst (dit voorkomt dat de agar uitdroogt en krimpt van de wand van de injectieflacon). Bewaar de doos met gegoten injectieflacons enkele dagen bij kamertemperatuur of maximaal 2 weken in een koelkast of koelruimte van 4 °C. Voordat u de opgeslagen injectieflacons gebruikt, haalt u ze uit de doos en laat u ze een uur of twee op kamertemperatuur op het aanrecht staan om de condensatie uit de injectieflacons te laten verdampen (de volwassen vliegen zouden aan het condensaat blijven plakken en verdrinken). 11. Pluggen voor flesjes maken Plaats een schone injectieflacon in een piepschuim reageerbuishouder van 50 ml (duw de buis erin zodat deze rechtop staat). Snijd een vierkant kaasdoek (2-4 lagen dik) en plaats deze op de flacon. Leg restjes kaasdoek van eerder gemaakte pluggen op de kaasdoek om een dikkere laag te creëren. Leg katoen op de kaasdoek en druk het in de injectieflacon, zorg ervoor dat u de bovenste centimeter van de injectieflacon stevig vult. Houd de bovenkant van de uiteinden van de kaasdoek bij elkaar en bind deze vast met een touwtje. Knip het overtollige touw en de overtollige kaasdoek af (laat voldoende staarten van het touw over om het vast te houden en voldoende kaasdoek om de plug comfortabel vast te pakken).NOTITIE: Monteer de stekkers zo dat ze goed vastzitten. Je zou ze met je wijs- en wijsvinger eruit moeten kunnen trekken terwijl je ze in één hand houdt. Als u de flacon bij de plug oppakt en deze valt eruit, dan zit deze te los. Als het een luid ploffend geluid maakt wanneer het wordt uitgetrokken, is het mogelijk te strak. Als het te strak zit of als er een laagje harde, droge agar op de plug zit, kunnen de vliegen stikken. Als de plug iets te los zit of langs de zijkanten van de flacon glijdt, kan deze op het aanrecht worden getikt om hem in een iets breder formaat te pletten. 12. Typisch weekschema (voer voor de grootste efficiëntie taken uit in de aangegeven volgorde) Maandag (~30 min)Voer injectieflacons met larven. Giet agar in steriele, schone injectieflacons met pluggen. Woensdag (~2 uur)Plaats flesjes met dode volwassenen 1 uur in een oven en bewaar ze om te wassen. Controleer op larven die “baby-hatch” zijn. Voer injectieflacons met larven. Voer wekelijkse paringskruisingen uit. Andere taken indien nodig: autoclaaf schone flacons met pluggen om indien nodig een reservevoorraad te hebben; maak nieuw voedsel en autoclaaf stro indien nodig; autoclaaf potten indien nodig voor voedsel en stro. Vrijdag (~30 min)Controleer op larven die “baby-hatch” zijn. Voer injectieflacons met larven.

Representative Results

De hier beschreven protocollen hebben geleid tot bewezen succes bij het kweken van B. coprophila. Wanneer recent gesloten vette volwassenen worden gekozen om te paren (Figuur 4), kan meer dan 90% van de kruisingen vruchtbaar zijn en nakomelingen opleveren. Het vruchtbaarheidssucces varieert wel bij verschillende bestanden (tabel 2). Voorraad 7298 (X’-chromosoom met golvende marker) was de gezondste van de bestanden, maar maakte een periode van achteruitgang door, blijkbaar als gevolg van activering van mobiele DNA-elementen die genoomherschikkingen creëerden32. De HoLo2-voorraad vertegenwoordigt een gezonde stam die is afgeleid van 7298, waar blijkbaar de herschikkingen van het genoom zijn gestabiliseerd, en het heeft de ouderlijke 7298-voorraad in het voorraadcentrum vervangen. De HoLo2-voorraad is degene die werd gebruikt om het genoom van B. coprophila te sequencen en wordt het meest gebruikt door verschillende laboratoriumgroepen. Onlangs is CRISPR-mutagenese van HoLo2-vliegen gebruikt om de W14-voorraad te creëren met een fenotype van witte ogen om te worden gebruikt voor transformatie met fluorescerende oogmarkers (Yamamoto en Gerbi, gegevens niet getoond). De W14-stam is uitzonderlijk robuust. De 6980 kolf (Wavy wing en swollen vein markers) is iets minder robuust en de 91S kolf (petite wing marker) is nog minder robuust. Succesvolle kruisingen resulteren in embryo’s (Figuur 5). Embryo’s ondergaan eliminatie van de ingeprinte vaderlijke X-chromosomenbij de 7e tot9e splitsingsafdeling . Bovendien worden kiembaanbeperkte L-chromosomen geëlimineerd uit de somatische afstamming in embryo’s bij de 5etot 6esplitsingsdivisie . De embryo’s komen tevoorschijn als larven, wat niet verward moet worden met schimmels die ook aanwezig kunnen zijn (Figuur 6). Oogvlekken (anlage naar de volwassen ogen) verschijnen in de tweede helft van de4e larvale instar (Figuur 7). De grootte van de oogvlekken biedt een handige fenotypische marker voor het begin en de progressie van DNA-trekamplificatie, wat een van de slechts twee bekende voorbeelden is van natuurlijk voorkomende ontwikkelingsgereguleerde plaatsspecifieke intrachromosomale DNA (gen) amplificatie. Vervolgens ontwikkelen poppen zich en de hoeveelheid pigment die hun ogen vult, kan dienen als een ontwikkelingsmarker voor meiose I en II in spermatogenese (Figuur 8) met zijn unieke chromosoomgedrag in deze divisies. Figuur 4: Paring van volwassen B. coprophila vliegen. Het bovenste paneel toont de drie soorten volwassen vliegen in de HoLo2-voorraad: vrouwtjes producerende moeders met golvende vleugels (X’WX volwassen vrouwtjes), mannetjes producerende moeders met rechte vleugels (XX volwassen vrouwtjes) en mannetjes met rechte vleugels (X0 volwassen mannetjes). Let op de puntige legboor aan het achterste uiteinde van de vrouwelijke vliegen en de haakvormige klem aan het achterste uiteinde van de mannelijke vliegen. Het onderste paneel toont een mannelijke en vrouwelijke paring, waarbij de mannelijke clasper de legboor van het vrouwtje heeft gegrepen. Het sperma wordt opgeslagen in de spermatheca van het vrouwtje en bevrucht de eieren terwijl ze naar buiten worden afgevoerd. De lengte van volwassenen is 2,0 mm (mannetjes), 2,5 mm (vrouwtjes). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: B. coprophila embryo’s. Het paneel linksboven is een weergave van embryo’s met behulp van standaardlicht in een ontleedmicroscoop; De kernen in het syncytiele cytoplasma verschijnen als zwarte stippen. Het paneel aan de rechterkant maakt gebruik van fluorescentiemicroscopie om de met propidiumjodide gekleurde kernen van embryo’s te visualiseren. De embryo’s hebben een gemiddelde lengte van 200 micron en een gemiddelde breedte van 150 micron. De kernen voor de kiemcellen clusteren zich aan de achterpool van het embryo, zoals te zien is in de cycli 6 (naar voren gekanteld embryo) en 7-9, waarna ze worden afgewisseld met somatische kernen. Eliminatie van het L-chromosoom in de somatische lijn vindt plaats in splitsingsdivisie 5 of 6; Eliminatie van het X-chromosoom in de somatische afstamming vindt plaats in de 7e, 8e of 9esplitsingsafdeling. Cellularisatie vindt plaats tijdens de interfase van cyclus 11. De tabel aan de linkerkant toont de gemiddelde tijdsduur voor elke divisiecyclus bij 22 °C. De tafel aan de linkerkant en het paneel aan de rechterkant zijn aangepast met toestemming van de Saint Phalle en Sullivan35. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: B. coprophila embryo’s komen tevoorschijn als larven. Een cluster van embryo’s (blauwe dikke pijl) is te zien in de buurt van de legboor van het volwassen vrouwtje dat stierf na het leggen van eieren. Een week na het leggen van de eieren worden de embryo’s jonge larven, van wie er verschillende worden aangegeven met de zwarte pijlen. De nieuw uitgekomen larven hebben een zwarte kaak aan het voorste uiteinde en een doorschijnend lichaam. Ze bewegen bovenop het agar-oppervlak en moeten niet worden verward met schimmel die niet beweegt. De inzet vertoont wat schimmel, met een wit filament (rode pijl) en een zwarte spore aan het uiteinde (groene pijl), en is iets kleiner dan de nieuw opgekomen larven. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7: Oogvlekkenstadia van B. coprophila larven. Oogvlekken vormen zich aan de voorkant van de larve, net achter de kaak, en zijn samengesteld uit pigmentkorrels die in aantal toenemen. De oogvlekken zijn de anlage van het volwassen oog. Het bovenste paneel toont larven die met een ontleedmicroscoop zijn gevisualiseerd; Het onderste paneel is een vergrote weergave van de oogvlekken met behulp van een fasecontrastmicroscoop om een larve op een microscoopglaasje te visualiseren met een druppel gedestilleerd water en een dekglaasje dat licht op de bovenkant drijft. De nomenclatuur van de oogspotstadia is volgens Gabrusewycz-Garcia30 , waarbij het aantal korrels wordt geteld in de langste rij (bijv. 12) en het aantal extra rijen exclusief de langste rij wordt genoteerd (bijv. 6 voor oogspotstadium 12×6). De start van plaatsspecifieke DNA-amplificatie in de speekselklier polyteenchromosomen begint in het oogvlekstadium 10×5 en wordt voltooid op 14×7 wanneer er een uitbarsting van transcriptie is op de locus en expansie van de DNA-pufjes31. In het daaropvolgende stadium van het randoog/de gevallen kaak beginnen de oogvlekkorrels samen te smelten en bewegen ze zijwaarts weg van de middellijn; De lengte van het larvale lichaam wordt korter. Verder condenseren de DNA-pufjes in dit stadium. Het duurt ongeveer een dag bij 21 °C om elk stadium van de oogvlek te doorlopen. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 8: Ontwikkeling van B. coprophila poppen. Tijdens de verpopping histolyseren alle larvale weefsels behalve het zenuwstelsel en worden ze vervangen door volwassen weefsels die ontstaan door celdelingen van de denkbeeldige schijven. De lichaamskleur verandert van wit naar bruin naar zwart naar bruin naar zwart. Pigment vult geleidelijk het popoog op; meiose I en II komen voor bij mannelijke poppen met ogen die voor 1/4 tot 1/2 gevuld zijn met pigment36. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Naam van de voorraad Markeringen Vruchtbaarheidscijfer Opmerkingen 7298 Golvende (W) vleugel ~75% HoLo2 zei: Golvende (W) vleugel ~90% afgeleid van 7298 W14 Golvende (W) vleugel; Witte ogen ~95% afgeleid van HoLo2 6980 Golvende (W) vleugel; Gezwollen (ZW) aderen ~65% JAREN 91 zwakke golvende (W) vleugel; Kleine (P) vleugels ~50% de Wavy marker werd geïntroduceerd in een kruis om 91S te redden Tabel 2: Bestanden van Bradysia (Sciara) coprophila. Tabel 1 van Gerbi6 geeft een overzicht van deze en andere markeringen die niet meer bestaan. Vijf translocaties (T1, T23, T29, T32, T70) aan het centromeeruiteinde van de X27 zijn samengevat in figuur 8 van Gerbi6 , maar bestaan niet meer. Aanvullend bestand 1: HoLo2 (en 7298 en W14) kruisen, 91S kruis en redding, 6980 kruis, translocatie kruisen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De hier gepresenteerde protocollen voor de veehouderij van B. coprophila zullen nuttig zijn voor wetenschappers die dit organisme in hun laboratoria willen kweken voor experimenten om zich te verdiepen in zijn unieke biologische kenmerken. De eerste beschrijving van de voedingsmethode met gist en paddenstoelenpoeder gestrooid op een agarbasis om B. coprophila²⁹ te behouden, werd in het laboratorium van Metz gebruikt om 14 verschillende soorten varenrouwmug te kweken⁵. Vervolgens werd vastgesteld dat de toevoeging van brandnetel- en/of spinaziepoeder de vitaliteit van B. coprophila verder verhoogde (Gabrusewycz-Garcia, persoonlijke communicatie). Deze methoden zijn succesvol geweest voor het behoud van verwante soorten binnen de familie Sciaridae, waaronder Bradysia impatiens en Lycoriella ingenua die momenteel in cultuur zijn (Robert Baird, persoonlijke communicatie).

Andere methoden (zoals de alternatieve voedingsmethoden die hieronder worden beschreven) zijn geprobeerd om B. coprophila te kweken, maar de hier beschreven protocollen zijn geoptimaliseerd om de meest gunstige verhouding larven per oppervlak van agar te hebben om de meest vruchtbare vetvolwassenen te verkrijgen en de groei van schimmel te minimaliseren. Om op te schalen, kan massaparing worden gedaan in glazen flacons zoals beschreven in protocol 2 hierboven. Als alternatief kunnen een paar (2-4) volwassen vrouwtjes samen met twee keer zoveel volwassen mannetjes in een kolf worden geplaatst, zoals die wordt gebruikt om Drosophila groot te brengen (wegwerp 6 oz. = 177,4 ml vierkante bodem Drosophila polypropyleen fles). In beide gevallen moet de onderzoeker er volledig op kunnen vertrouwen dat de kolf alleen moeders bevat die door vrouwen of door mannen worden geproduceerd.

Voer de larven alleen, want de poppen en volwassenen eten niet. Voer de injectieflacon niet als de larven in poppen zijn veranderd (een teken hiervan is wanneer de eerste vroeg opkomende volwassen vliegen verschijnen). Zodra de volwassenen sluiten, plaatst u de injectieflacons in een koelere couveuse (bijv. 16 °C) indien beschikbaar, omdat de volwassenen hierdoor langer kunnen leven. Voer drie keer per week (bijv. maandag, woensdag, vrijdag) en verhoog de hoeveelheid voer die per injectieflacon wordt gegeven naarmate de larven ouder worden. Voer royaal en je wordt beloond met vette, vruchtbare volwassenen. Als u echter te veel voert, verschijnt er witte schimmel en dat is een teken om de hoeveelheid voedsel die u in een injectieflacon deponeert te verminderen. Verder, als je te veel voert, zal er een dikke pad met voedsel bovenop de agar ontstaan en het moeilijker maken voor de volwassenen om tevoorschijn te komen (je kunt de pad met een tang verwijderen, maar pas op dat je geen larven meeneemt met de pad – het is het beste om dit helemaal niet te hoeven doen). Injectieflacons met weinig larven (gemarkeerd met “weinig”) hebben minder voedsel nodig. Als je te weinig voert, zullen de larven langs de wanden van de flacon klimmen op zoek naar voedsel. Ondervoede larven resulteren in kleine volwassen larven die minder vruchtbaar zijn.

Alternatieve voedingsmethoden
Er zijn verschillende methoden geprobeerd om larven slechts één keer tijdens het larvale stadium te voeren in plaats van 3 keer per week. B. coprophila groeit niet op voedsel in Drosophila-stijl . John Urban (persoonlijke communicatie) probeerde B. coprophila-voedsel te mengen met de agar, maar er groeide te veel schimmel. Hij ontdekte dat het toevoegen van twee schimmelremmers (tegosept en propionzuur) in combinatie en afzonderlijk, waarbij verschillende concentraties werden geprobeerd, allemaal giftig waren voor B. coprophila op niveaus die schimmel remmen. De agar moet pH 6-7 (neutraal) zijn , omdat B. coprophila ziek wordt bij een zure pH (zoals bij propianinezuur). Als alternatief, om driemaal per week voeden te voorkomen, probeerde hij een spatel of spuit zonder naald te gebruiken om een dikke gistpasta (Red Star actieve droge gist gemengd met een beetje gedestilleerd water om het te bevochtigen) als een klodder bovenop de agar in elke flacon een week na het paren (d.w.z. rond de tijd dat de larven beginnen te verschijnen).

Een andere methode om driemaal per week voeding te vermijden, is door aan elke flacon een levende cultuur van schimmels toe te voegen. Bath en Sponsler³⁷ meldden dat een schuin agar-oppervlak met het medium van Sabouraud besmeurd moest zijn met een schimmelcultuur van de geslachten Chaetoconidia (best) of anders Baplosporangia of Xllescheria. De schimmel werd enkele dagen tot een week voordat B. coprophila werd geïntroduceerd gekweekt. Hierna was er geen voeding meer nodig. Een variant van deze methode werd ook gebruikt door Ellen Rasch (persoonlijke communicatie). In onze handen waren de flesjes te nat met deze methode en verdronken de larven, maar het kon opnieuw worden geprobeerd om het aantal larven te optimaliseren ten opzichte van de flesjes met levende schimmels.

Arthur Forer (persoonlijke communicatie) heeft enig succes gehad met het kweken van B. coprophila op dezelfde manier als kraanvogels³⁸. Met deze aanpak werden poppen gekweekt op vochtig papier-maché. Vervolgens werden de volwassen dieren gedekt en werden de eieren afgezet op vers, vochtig papier-maché. De resulterende larven werden op papier-maché in petrischaaltjes gehouden en twee keer per week gevoed met brandnetelbladeren in poedervorm. Poppen werden in een kooi gestopt om de cyclus te herhalen.

Yukiko Yamashita (persoonlijke communicatie) heeft tevergeefs geprobeerd om B. coprophila op aarde te kweken, waarbij hij de omstandigheden nabootst waarin ze in de natuur worden aangetroffen in potplanten en kassen met een hoge luchtvochtigheid. Schimmel kan echter een probleem worden wanneer de luchtvochtigheid wordt verhoogd. Desalniettemin is vochtige grond met succes gebruikt om Pseudolycoriella (voorheen Bradysia) hygida-larven te kweken in plastic dozen met vochtige grond; ze worden gevoed met afgebroken Ilex paraguariensis bladeren, in het late larvale leven aangevuld met 1,2% gistextract, 1,4% maizena, 0,8% havermoutmeel, 1,2% agar¹². Op dezelfde manier kan de vochtige grond worden vervangen door vochtig veenmos met gemalen bruine bonen om varenrouwmugvliegen te kweken^39,40.

Er zijn nog andere methoden gebruikt om laboratoriumculturen van Bradysia in stand te houden: (i) geautoclaveerde aardappel waaraan gist en gedroogde bloedmeststof zijn toegevoegd⁴¹; ii) mest 42,43,44 waaraan gedroogd bloed kan worden toegevoegd ⁴⁵; iii) plastic recipiënten met wattenschijfjes en vochtig keukenpapier met gemalen sojabonen⁴⁶.

Mijten
Mijten kunnen worden overgedragen van Drosophila naar B. coprophila. Om dit tot een minimum te beperken, is het het beste om B. coprophila in een aparte incubator of kamer te bewaren, niet in de buurt van Drosophila-bestanden . Voer bovendien eventuele onderhoudswerkzaamheden aan B. coprophila vroeg op de dag uit voordat u Drosophila aanraakt. Mijten kunnen ook van kamerplanten worden overgebracht naar B. coprophila , dus houd planten niet in dezelfde ruimte als B. coprophila. Als mijten de flesjes binnendringen, kunnen ze worden gezien als kleine witte bolvormige organismen die op het lichaam van B. coprophila kruipen. Chemische behandelingen die werken om mijten in Drosophila te vernietigen, kunnen niet worden gebruikt voor B. coprophila, omdat de chemicaliën B. coprophila doden (B. coprophila is ook gevoelig voor organische dampen zoals fenol). De enige behandeling om B. coprophila-voorraden van mijten te ontdoen, is door de embryo’s handmatig op een agarplaat te verzamelen, ze allemaal te onderzoeken op de afwezigheid van mijten en ze vervolgens met een fijne kwast over te brengen in verse agarflesjes. Met katoen gevulde gaaspluggen en flugs van celluloseacetaatschuim (zoals gebruikt voor Drosophila polypropyleen injectieflacons) helpen beide om het binnendringen van mijten in de injectieflacons te voorkomen.

Nut van de houderijprotocollen
De hier beschreven protocollen zullen de groeiende gemeenschap van wetenschappers in staat stellen om B. coprophila te kweken als een nieuw/oud opkomend modelorganisme om zijn unieke biologische kenmerken te bestuderen. Nieuwe laboratoriumgroepen worden aangemoedigd om zich aan te sluiten bij de groeiende gemeenschap om de unieke biologische kenmerken van Bradysia (Sciara) te behouden en te onderzoeken.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Speciale dank aan eerdere B. coprophila veehouders (Jacob E. Bliss, Paula Bonazinga, Anne W. Kerrebrock, Ingrid M. Mercer, Heidi S. Smith) en onderzoekspersoneel (vooral Robert Baird, Michael S. Foulk, Donna Kubai, John M. Urban, Yutaka Yamamoto) voor het verfijnen van de houderijprotocollen. De eerste instructies over de verzorging van B. coprophila werden gegeven door Helen V. Crouse, Natalia Gabrusewycz-Garcia, Reba M. Goodman, Charles W. Metz en Ellen Rasch. Met dank aan Yukiko Yamashita en Anne W. Kerrebrock voor het overnemen van het Bradysia (Sciara) voorraadcentrum. Veel waardering voor de volgende personen voor hun behulpzame voorbereiding van de figuren: Brian Wiegmann (Figuur 1), John M. Urban (Figuur 4 bovenpaneel), Laura Ross (Figuur 4 onderpaneel), Yutaka Yamamoto (Figuur 5 linkerpaneel), Leo Kadota (Figuur 7 en Figuur 8). Veel dank aan Ava Filiss en het Brown University Multidisciplinary Laboratory voor hun hulp bij het fotograferen en filmen. Met dank aan Robert Baird voor zijn commentaar op dit manuscript. Ons onderzoek en onderhoud van B. coprophila is ondersteund door NIH en NSF, inclusief de meest recente steun van NIH GM121455 aan S.A.G. Verdere details over B. coprophila zijn beschikbaar op de Bradysia (Sciara) Stock Center websites (https://sites.brown.edu/sciara/ en https://sciara.wi.mit.edu) die momenteel worden gebouwd.

Materials

Agar (bacteriological)	U.S. Biological	A0930	https://www.usbio.net;
CO₂ FlyStuff Foot Pedal	Genesee Scientific	59-121
CO2 FlyStuff Blowgun	Genesee Scientific	54-104
CO2 FlyStuff UltimaterFlypad	Genesee Scientific	59-172	https://www.geneseesci.com
Ether fume hood	Labconco	3955220	Sits on top of lab bench
			Filter replacement cat # 6961300
Food: Brewer’s Yeast Powder	Solgar		Obtain from Amazon or health food store
			https://www.solgar.com;
Food: Nettle Powder (pesticide free)	Starwest Botanicals	209460-51
Food: Shitake Mushrooms (pesticide free)	Starwest Botanicals	202127-5	https://www.starwest-botanicals.com;
Food: Spinach Powder ( pesticide free)	Starwest Botanicals	209583-5
Food: Straw (pesticide free )	Starwest Botanicals	209465-3
Jar: clear glass, polypropylene lid	Fisher Scientific:	FB02911765	73 mm dia, 89 mm ht (240 ml) https://www.fishersci.com;
Needle Probe, wooden handle	US Geo Supply Inc	SKU: 4190	5.75” long probe, stainless steel needle https://usgeosupply.com; (970)-434-3708
Vials: glass, preferred:	Wilmad LabGlass
Wilmad-glass custom vials			28-33 mm inner dia, 33 mm outer dia, 9.5 cm ht Wilmad: https://www.SP-WilmadLabglass.com
Vials: glass (cheaper and ok)	Fisher Scientific	03-339-26H	29 mm outer dia, 9.5 cm h https://www.fishersci.com;
Vials: glass (a bit narrow)	Genesee Scientific	32-201	24.5 mm outer dia,9.5 cm h thttps://www.geneseesci.com
Vials: polypropylene	Genesee Scientific	32-114	28.5 mm outer dia,9.5 cm ht
Vial Plugs
roll of non-absorbent cotton	Fisher Scientific	22-456881
cheesecloth	Fisher Scientific	22-055053	https://www.fishersci.com;

References

Lewin, H. A., et al. Earth BioGenome project: Sequencing life for the future of life. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (17), 4325-4333 (2018).
Wiegmann, B. M., et al. Episodic radiations in the fly tree of life. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (14), 5690-5695 (2011).
Yeates, D. K., Wiegmann, B. M. Phylogeny of Diptera. Manual of Afrotropical Diptera.Suricata. 3, 149-161 (2017).
Vilkamaa, P., Burdíková, N., Ševčík, J. The genus Spinopygina gen. nov. (Diptera, Sciaridae) from Western North America: Preliminary molecular phylogeny and description of seven new species. Insects. 14 (2), 173 (2023).
Metz, C. W. Chromosome behavior, inheritance and sex determination in Sciara. Amer Naturalist. 72 (743), 485-520 (1938).
Gerbi, S. A., Hennig, N. Unusual chromosome movements in Sciarid flies. Results and Problems in Cell Differentiation. Vol 13 Germ Line – Soma Differentiation. 13, 71-104 (1986).
Gerbi, S. A., Larracuente, A., Hanlon, S. Non-random chromosome segregation and chromosome eliminations in the fly Bradysia (Sciara). 34;Non-Mendelian Inheritance and Meiotic Drive.", Chromosome Research.(special issue). 30, 273-288 (2022).
Steffan, W. A. A generic revision of the family Sciaridae (Diptera) of America North of Mexico. University of California Publications in Entomology. 44, 1-77 (1966).
Shin, S., Jung, S., Menzel, F., Heller, K., Lee, H. Molecular phylogeny of black fungus gnats (Diptera: Sciaroidea: Sciaridae) and the evolution of larval habitats. Molec Phylogenetics Evolution. 66 (3), 833-846 (2013).
Mohrig, W., Heller, K., Hippa, H., Vilkamaa, P., Menzel, F. Revision of the black fungus gnats (Diptera: Sciaridae) of North America. Studia Dipterologica. 19 (1-2), 141-286 (2013).
Ševčík, J., et al. Molecular phylogeny of the megadiverse insect infraorder Bibionomorpha sensu lato (Diptera). PeerJ. 4, e2563 (2016).
Menzel, F., et al. Pseudolycoriella hygida (Sauaia and Alves)-An overview of a model organism in genetics, with new aspects in morphology and systematics. Insects. 15 (2), 118 (2024).
Meigen, J. W. . Klassifikazion und Beschreibung der europäischen zweiflügligen Insekten (Diptera Linn). 1 (1), (1804).
Johannsen, O. A. The fungus gnats of North America part I. Maine Agricultural Experimental Station Bulletin. 172, 209-276 (1909).
Johannsen, O. A. Mycetophilidae of North America. Maine Agricultural Experimental Station Bulletin. 200, 57-146 (1912).
Urban, J. M., et al. Bradysia (Sciara) coprophila larvae up-regulate DNA repair pathways and down-regulate developmental regulators in response to ionizing radiation. 유전학. (3), (2024).
Hodson, C. N., Jaron, K. S., Gerbi, S., Ross, L. Gene-rich germline-restricted chromosomes in black-winged fungus gnats evolved through hybridization. PLoS Biology. 20 (2), e3001559 (2021).
Urban, J. M., et al. High contiguity de novo genome assembly and DNA modification analyses for the fungus fly, Sciara coprophila, using single-molecule sequencing. BMC Genomics. 22, 643 (2021).
Baird, R. B., et al. Recent evolution of a maternally acting sex-determining supergene in a fly with single-sex broods. Mol Biol Evol. 40 (7), (2023).
Yamamoto, Y., Gerbi, S. A. Making ends meet: targeted integration of DNA fragments by genome editing. Chromosoma. 127 (4), 405-420 (2018).
Yamamoto, Y., Gerbi, S. A. Development of transformation for genome editing of an emerging model organism. Genes. 13 (7), 1108-1124 (2022).
Metz, C. W., Smith, H. B. Further observation on the nature of the x-prime (X’) chromosome in Sciara. Proc Nat Acad Sci USA. 17 (4), 195-198 (1931).
Crouse, H. V. X-ray induced sex-linked recessive lethals and visibles in Sciara coprophila. Amer Naturalist. 95 (880), 21-26 (1961).
Metz, C. W., Ullian, S. S. Genetic identification of the sex chromosomes in Sciara (Diptera). Proc Nat Acad Sci USA. 15 (2), 82-85 (1929).
Crouse, H. V. X heterochromatin subdivision and cytogenetic analysis in Sciara coprophila (Diptera, Sciaridae). I. Centromere localization. Chromosoma. 63, 39-55 (1977).
Crouse, H. V., Gerbi, S. A., Liang, C. M., Magnus, L., Mercer, I. M. Localization of ribosomal DNA within the proximal X heterochromatin of Sciara coprophila (Diptera, Sciaridae). Chromosoma. 64 (4), 305-318 (1977).
Crouse, H. V. X heterochromatin subdivision and cytogenetic analysis in Sciara coprophila (Diptera, Sciaridae). II. The controlling element. Chromosoma. 74, 219-239 (1979).
Mok, E. H., et al. Maintenance of the DNA puff expanded state is independent of active replication and transcription. Chromosoma. 110 (3), 186-196 (2001).
Smith-Stocking, H. Genetic studies on selective segregation of chromosomes in Sciara coprophila Lintner. 유전학. 21 (4), 421-443 (1936).
Gabrusewycz-Garcia, N. Cytological and autoradiographic studies in Sciara coprophila salivary gland chromosomes. Chromosoma. 15, 312-344 (1964).
Wu, N., Liang, C., DiBartolomeis, S. M., Smith, H. S., Gerbi, S. A. Developmental progression of DNA puffs in Sciara coprophila: amplification and transcription. Dev Biol. 160 (1), 73-84 (1993).
Yamamoto, Y., Gustafson, E. A., Foulk, M. S., Smith, H. S., Gerbi, S. A. Anatomy and evolution of a DNA replication origin. Chromosoma. 130 (2-3), 199-214 (2021).
Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
Bertone, M. A., Courtney, G. W., Wiegmann, B. M. Phylogenetics and temporal diversification of the earliest true flies (Insecta: Diptera) based on multiple nuclear genes. Syst Entomol. 33, 668-687 (2008).
de Saint Phalle, B., Sullivan, W. Incomplete sister chromatid separation is the mechanism of programmed chromosome elimination during early Sciara coprophila embryogenesis. Development. 122 (12), 3775-3784 (1996).
de Saint Phalle, B., Oldenbourg, R., Kubai, D., Salmon, E. D., Gerbi, S. A. Paternal chromosome elimination and X non-disjunction on asymmetric spindles in Sciara male meiosis. BioRxiv. , (2021).
Bath, J. D., Sponsler, O. L. An alternative method for the culture of Sciara larvae. Science. 109 (2828), 255 (1949).
Forer, A. Crane fly spermatocytes and spermatids: A system for studying cytoskeletal components. Methods Cell Biol. 25, 227-252 (1982).
Gillespie, D. R. A simple rearing method for fungus gnats Corynoptera sp. (Diptera: Sciaridae) with notes on life history. J Entomol Soc Br Colum. 83, 45-48 (1986).
Gardiner, R. B., Jarvis, W. R., Shipp, J. L. Ingestion of Pythium spp. by larvae of the fungus gnat Bradysia impatiens (Diptera: Sciaridae). Ann Appl Biol. 116, 205-212 (1990).
Hungerford, H. B. Sciara maggots injurious to potted plants. J Econ Entomol. 9 (6), 538-549 (1916).
Thomas, C. A. A method for rearing mushroom insects and mites. Entomol News. 40, 222-225 (1929).
Austin, M. D., Pitcher, R. S. A laboratory method for rearing Sciara and phorid flies. Entomol Mon Mag. 72, 12-15 (1936).
Butt, F. H., Galtsoff, P. S., Lutz, F. E., Welch, P. S., Needham, J. G. Culture of Sciara. Culture methods for invertebrate animals. , 400-401 (1937).
Hudson, E. K. Regulation of greenhouse sciarid fly populations using Tetradonema plicans (Nematoda: Mermithoidea). J Invert Pathol. 23 (1), 85-91 (1974).
Wilkinson, J. D., Daughterty, D. M. Comparative development of Bradysia impatiens (Diptera: Sciaridae) under constant and variable temperatures. Ann Entomol Soc Am. 63 (4), 1079-1083 (1970).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Gerbi, S. A. Laboratory Maintenance of the Lower Dipteran Fly Bradysia (Sciara) coprophila: A New/Old Emerging Model Organism. J. Vis. Exp. (206), e66751, doi:10.3791/66751 (2024).