Summary

13МечениеC6-глюкозы, ассоциированное с LC-MS: идентификация первичных органов растений в синтезе вторичных метаболитов

Published: March 22, 2024
doi:

Summary

Разработанный метод мечения 13C6-Glucose в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения жидкостной хроматографии является универсальным и закладывает основу для будущих исследований первичных органов и путей, участвующих в синтезе вторичных метаболитов в лекарственных растениях, а также комплексной утилизации этих вторичных метаболитов.

Abstract

В данной работе представлен новый и эффективный метод сертификации первичных органов, участвующих в синтезе вторичных метаболитов. В качестве важнейшего вторичного метаболита у Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Рука. -Mzt. (PPY), сапонин парижский (PS) обладает разнообразной фармакологической активностью, и PPY пользуется все большим спросом. В этом исследовании было установлено, что листья, корневище и стеблево-сосудистый пучок 13C6-глюкозы с кормлением и без кормления точно сертифицируют первичные органы, участвующие в синтезе парижских сапонинов VII (PS VII). Комбинируя жидкостную хроматографию-масс-спектрометрию (ЖХ-МС), были быстро и точно рассчитаны соотношения 13C/12C листьев, корневища, стебля и корня при различных обработках, а также были обнаружены четыре типа соотношений изотопических ионов PS (M): (M+1) /M, (M+2) /M, (M+3) /M и (M+4) /M. Результаты показали, что соотношение 13С/12С в корневищах при лечении стволовым сосудистым пучком и корневищем было значительно выше, чем при лечении без кормления. По сравнению с обработкой без кормления, соотношение молекул PS VII (M+2) /M в листьях значительно увеличивалось при обработке листьев и стеблевых, сосудисто-пучковых пучков. В то же время, по сравнению с обработкой без подкормки, соотношение молекул PS VII (М+2) в листьях при обработке корневищем не показало существенной разницы. Кроме того, соотношение молекул PS VII (M+2) /M в стебле, корне и корневище не показало различий между четырьмя обработками. По сравнению с обработкой без подкормки, соотношение молекулы парижского сапонина II (PS II) (M+2) /M в листьях при листовой обработке не показало существенной разницы, а соотношение (M+3) /M молекул PS II в листьях при листовой обработке было ниже. Данные подтвердили, что первичным органом для синтеза PS VII являются листья. Это закладывает основу для будущей идентификации первичных органов и путей, участвующих в синтезе вторичных метаболитов в лекарственных растениях.

Introduction

Пути биосинтеза вторичных метаболитов в растениях сложны и разнообразны, в них задействованы высокоспецифичные иразнообразные органы накопления. В настоящее время специфические места синтеза и органы, ответственные за вторичные метаболиты во многих лекарственных растениях, четко не определены. Эта неопределенность представляет собой серьезное препятствие для стратегического продвижения и внедрения методов выращивания, разработанных для оптимизации как урожайности, так и качества лекарственных материалов.

Молекулярная биология, биохимия и методы мечения изотопов широко используются для раскрытия путей синтеза и сайтов вторичных метаболитов в лекарственных растениях 2,3,4,5, и каждая из этих методологий демонстрирует уникальные сильные стороны и ограничения, такие как различия в эффективности и точности. Подходы молекулярной биологии, например, обеспечивают высокую точность в определении сайтов в биосинтетических путях, но требуют значительного времени. Их полезность еще больше ограничена для видов, у которых отсутствуют общедоступные геномные последовательности, что делает эти методы менее жизнеспособными длятаких случаев. В противоположность этому, методы мечения изотопов, использующие изотопные соотношения, такие как 3C/12C, 2H/1H и 18O/16O, обеспечивают быстрые и доступные средства для исследования механизмов синтеза, транспортировки и хранения вторичных метаболитов 7,8. Они могут выявить пространственное распределение органических соединений и стабильных изотопов в листьях, тем самым позволяя реконструировать условия окружающей среды, с которыми сталкиваются листья на протяжении всего ихжизненного цикла. Кроме того, применение внешних изотопных меток, таких как 13C6-Glucose 10 и 13C 6-Phenylalanine11, позволяет генерировать меченные углеродом вторичные метаболиты, улучшая наше понимание их производства и функции.

Традиционные методы мечения изотопов углерода сталкиваются с трудностями в определении конкретных органов, ответственных за синтез вторичных метаболитов, из-за высокой видоспецифичной природы их биосинтетических путей и механизмов транспортировки. Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ-МС) приобрела известность в качестве ключевого аналитического инструмента в этой области, предлагая надежный метод отслеживания экзогенных изотопов в химическом синтезе лекарств и исследования in vivo таких процессов, как абсорбция, распределение, метаболизм и экскреция. Превосходная чувствительность, прямолинейность и надежность ЖХ-МС делают его идеальным выбором для мониторинга производства вторичных метаболитов на предприятиях13. В последнее время LC-MS становится все более предпочтительным для его применения в методах мечения внешними изотопами, что позволяет оценить эффективность мечения для различных образцов. Данная методология дает критическое представление о первичных органах, участвующих в синтезе вторичных метаболитов лекарственных растений, служа неоценимым дополнением к биологическим методам идентификации органов синтеза этих соединений14,15. Следовательно, такой подход не только облегчает сравнение эффективности мечения среди различных образцов, но и проливает свет на ключевые органы, участвующие в образовании вторичных метаболитов растений, тем самым улучшая наше понимание их биосинтеза.

Мы представили новый метод, который сочетает мечение изотопов углерода с обнаружением LC-MS для идентификации первичных органов, ответственных за синтез вторичных метаболитов в лекарственных растениях. Парижский сапонин (ПС) обладает различными фармакологическими свойствами, такими как противоопухолевое, иммуномодулирующее и противовоспалительное16, а ППИ пользуется все большим спросом17. Таким образом, мы использовали проростки PPY в качестве объектов исследования и расшифровали, что листья являются основным органом для синтеза парижского сапонина VII (PS VII) (рис. 1B) с помощью мечения 13C6-Glucose, связанного с методом LC-MS. Наш подход включал в себя четыре различных метода лечения, включающих подачу 13С-6-глюкозы в листья, корневище и стеблево-сосудистые пучки, а также контроль без кормления. Выбор 13С-6-глюкозы является стратегическим, так как она быстро метаболизируется в ацетилкоэнзим А посредством дыхания, что в свою очередь способствует синтезу ФС. Используя естественное содержание 13C, мы использовали систему газовой хроматографии и масс-спектрометра стабильных изотопных отношений (GC-IRMS) для оценки соотношений 13C/12C в различных органах растений и для анализа изотопных ионных пиковых отношений в молекулах PS VII и парижских сапонинов II (PS II) (рис. 1B). Наша методология, в которой используются 13меченых С предшественников вторичных метаболитов растений и передовые методы масс-спектрометрии, предлагает более простую и точную альтернативу традиционным методам мечения изотопами углерода. Этот новый подход не только углубляет наше понимание органов, участвующих в синтезе вторичных метаболитов в лекарственных растениях, но и закладывает прочную основу для будущих исследований биосинтетических путей этих соединений.

Protocol

1. Подготовка к эксперименту Убедитесь, что во время роста растений относительная влажность воздуха в теплице составляет 75%, дневная/ночная температура составляет 20 °C/10 °C, фотопериод состоит из 12 часов дня и 12 часов ночи, а интенсивность света составляет 100 моль·м-2·<s…

Representative Results

Чтобы подтвердить, что поступление 13С-6-глюкозы в корневища было успешным, мы дополнительно проанализировали соотношения изотопов 13С/12С в корневищах. Соотношение изотопов 13C/12C в Обработке 3 и 4 было намного выше, чем в Обработке 2 (Рисунок 1A</s…

Discussion

Успешная реализация этого протокола зависит от всесторонних исследований физиологических свойств растений, тканей, органов и вторичных метаболитов. Подход к планированию эксперимента, изложенный в протоколе, закладывает прочную основу для исследования путей биосинтеза вторичных ме…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась Национальным фондом естественных наук Молодежной программы Китая (No 82304670).

Materials

0.1 % Formic acid water Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory 44890
13C6-Glucose powder MERCK 110187-42-3
Acetonitrile Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory 44890
AUTOSAMPLER VIALS Biosharp Biotechnology Company 44866
BEH C18 column Waters,Milfor,MA 1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleaner Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software Thermo Scientific, Fremont,CA 3
Compound DiscovererTM  software  Thermo Scientific,Fremont,CA 3
Electric constant temperature blast drying oven DHG-9146A
Electronic analytical balance Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd SOP
Ethanol  Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory 44955
Fully automatic sample rapid grinder Shanghai Jingxin Technology Tissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer Thermo Fisher Delta V Advantage
Hoagland solution Sigma-Aldrich H2295-1L
Hydroponic tank JRD 1020421
Isodat software Thermo Fisher Scientific 3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry Agilent Technology  Agilent 1260 -6120 
Nitrogen manufacturing instrument PEAK SCIENTIFIC Genius SQ 24
Organic phase filter Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd 44890
Oxygen pump Magic Dragon MFL
Quantum sensor Highpoint UPRtek
Scalpel Handskit 11-23
Sprinkling can CHUSHI WJ-001
Xcalibur  software Thermo Fisher Scientific 4.2

References

  1. Erb, M., Kliebenstein, D. J. Plant secondary metabolites as defenses, regulators, and primary metabolites: The blurred functional trichotomy. Plant Physiol. 184 (1), 39-52 (2020).
  2. Li, Y., Kong, D., Fu, Y., Sussman, M. R., Wu, H. The effect of developmental and environmental factors on secondary metabolites in medicinal plants. Plant Physiol Biochem. 148, 80-89 (2020).
  3. Liu, S., et al. Genetic and molecular dissection of ginseng (panax ginseng mey.) germplasm using high-density genic snp markers, secondary metabolites, and gene expressions. Front Plant Sci. 14, 1165349 (2023).
  4. Chen, X., Wang, Y., Zhao, H., Fu, X., Fang, S. Localization and dynamic change of saponins in cyclocarya paliurus (batal.) iljinskaja. PloS One. 14 (10), e0223421 (2019).
  5. Yuan, M., et al. Ex vivo and in vivo stable isotope labelling of central carbon metabolism and related pathways with analysis by lc-ms/ms. Nat Protoc. 14 (2), 313-330 (2019).
  6. Cavalli, F. M. G., Bourgon, R., Vaquerizas, J. M., Luscombe, N. M. Specond: A method to detect condition-specific gene expression. Genome Biol. 12 (10), 101 (2011).
  7. Epron, D., et al. Pulse-labelling trees to study carbon allocation dynamics: A review of methods, current knowledge and future prospects. Tree Physiology. 32 (6), 776-798 (2012).
  8. Varman, A. M., He, L., You, L., Hollinshead, W., Tang, Y. J. Elucidation of intrinsic biosynthesis yields using 13c-based metabolism analysis. Microb Cell Fact. 13 (1), 42 (2014).
  9. Meng-Meng, G., Zhen-Yu, Z., Yu, Z., Qiu-Lin, Y., Ying, W. Systematic extraction and stable isotope determination of different biomarkers from single leaf of reticulate vein plants. Journal of Shaanxi University of Science & Technology. 41 (01), 72-79 (2023).
  10. Zhang, H., et al. A convenient lc-ms method for assessment of glucose kinetics in vivo with d-[13c6]glucose as a tracer. Clin Chem. 55 (3), 527-532 (2009).
  11. Chassy, A. W., Adams, D. O., Waterhouse, A. L. Tracing phenolic metabolism in vitis vinifera berries with 13c6-phenylalanine: Implication of an unidentified intermediate reservoir. J Agric Food Chem. 62 (11), 2321-2326 (2014).
  12. Lozac’h, F., et al. Evaluation of cams for 14c microtracer adme studies: Opportunities to change the current drug development paradigm. Bioanalysis. 10 (5), 321-339 (2018).
  13. Sulyok, M., Stadler, D., Steiner, D., Krska, R. Validation of an lc-ms/ms-based dilute-and-shoot approach for the quantification of &gt; 500 mycotoxins and other secondary metabolites in food crops: Challenges and solutions. Anal Bioanal Chem. 412 (11), 2607-2620 (2020).
  14. Serra, F., et al. Inter-laboratory comparison of elemental analysis and gas chromatography combustion isotope ratio mass spectrometry (gc-c-irms). Part i: Delta13c measurements of selected compounds for the development of an isotopic grob-test. J Mass Spectrom. 42 (3), 361-369 (2007).
  15. Jung, J. -. Y., Oh, M. -. K. Isotope labeling pattern study of central carbon metabolites using gc/ms. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 101-108 (2015).
  16. Ding, Y. G., et al. The traditional uses, phytochemistry, and pharmacological properties of paris l. (liliaceae): A review. J Ethnopharmacol. 278, 114293 (2021).
  17. Cunningham, A. B., et al. Paris in the spring: A review of the trade, conservation and opportunities in the shift from wild harvest to cultivation of paris polyphylla (trilliaceae). J Ethnopharmacol. 222, 208-216 (2018).
  18. Madikizela, L. M., Ncube, S., Chimuka, L. Uptake of pharmaceuticals by plants grown under hydroponic conditions and natural occurring plant species: A review. Sci Total Environ. 636, 477-486 (2018).
  19. Tagami, K., Uchida, S. Online stable carbon isotope ratio measurement in formic acid, acetic acid, methanol and ethanol in water by high performance liquid chromatography-isotope ratio mass spectrometry. Anal Chim Acta. 614 (2), 165-172 (2008).
  20. Li, Y., et al. The combination of red and blue light increases the biomass and steroidal saponin contents of paris polyphylla var. Yunnanensis. Ind Crops Prod. 194, 116311 (2023).
  21. Wang, G., et al. Tissue distribution, metabolism and absorption of rhizoma paridis saponins in the rats. J Ethnopharmacoly. 273, 114038 (2021).
  22. Peng, S., et al. Progress in the study of differences in the types and contents of steroidal saponins in paris. Polyphylla smith var. Chinensis (franch.) hara. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 24 (05), 2014-2025 (2022).
  23. Alami, M. M., et al. The current developments in medicinal plant genomics enabled the diversification of secondary metabolites’ biosynthesis. Int J Mol Sci. 23 (24), 15932 (2022).
  24. Wen, F., et al. The synthesis of paris saponin vii mainly occurs in leaves and is promoted by light intensity. Front Plant Sci. 14, 1199215 (2023).
  25. Siadjeu, C., Pucker, B. Medicinal plant genomics. BMC Genomics. 24 (1), 429 (2023).
  26. Tian, C., et al. Top-down phenomics of arabidopsis thaliana: Metabolic profiling by one- and two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy and transcriptome analysis of albino mutants. J Biol Chem. 282 (25), 18532-18541 (2007).
  27. Masakapalli, S. K., et al. Metabolic flux phenotype of tobacco hairy roots engineered for increased geraniol production. Phytochemistry. 99, 73-85 (2014).
  28. Schwender, J., Ohlrogge, J. B., Shachar-Hill, Y. A flux model of glycolysis and the oxidative pentosephosphate pathway in developing brassica napus embryos. J Biol Chem. 278 (32), 29442-29453 (2003).

Play Video

Cite This Article
Chen, S., Chang, F., Lin, L., Wang, Y., Wen, F., Zhou, T., Pei, J. 13C6-Glucose Labeling Associated with LC-MS: Identification of Plant Primary Organs in Secondary Metabolite Synthesis. J. Vis. Exp. (205), e66578, doi:10.3791/66578 (2024).

View Video