Summary

13C6-תיוג גלוקוז הקשור LC-MS: זיהוי של איברים ראשוניים צמחיים בסינתזת מטבוליטים משנית

Published: March 22, 2024
doi:

Summary

השיטה שפותחה של תיוג 13C6-Glucose בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית ברזולוציית מסה ברזולוציה גבוהה היא רב-תכליתית ומניחה את הבסיס למחקרים עתידיים על האיברים והמסלולים העיקריים המעורבים בסינתזה של מטבוליטים שניוניים בצמחי מרפא, כמו גם ניצול מקיף של מטבוליטים שניוניים אלה.

Abstract

מאמר זה מציג שיטה חדשנית ויעילה לאישור איברים ראשוניים המעורבים בסינתזת מטבוליטים שניונית. כמטבוליט המשני החשוב ביותר בפריזפוליפילה var. yunnanensis (Franch.) יד. -Mzt. (PPY), פריז saponin (PS) יש מגוון רחב של פעילויות פרמקולוגיות PPY הוא ביקוש גובר. מחקר זה ביסס עלים, קני שורש וצרור גזע-כלי דם 13C6-גלוקוז הזנה ולא הזנה ארבעה טיפולים כדי לאשר במדויק את האיברים העיקריים המעורבים בסינתזת פריז ספונינים VII (PS VII). על ידי שילוב ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית (LC-MS), חושבו במהירות ובמדויק היחסים של 13C/12C של עלה, קנה שורש, גזע ושורש בטיפולים שונים, ונמצאו ארבעה סוגים של יחסי שיא יונים איזוטופיים PS (M): (M+1) /M, (M+2) /M, (M+3) /M ו-(M+4) /M. התוצאות הראו כי היחס של 13C/12C בקני השורש של צרור גזע-כלי דם וקני שורש היה גבוה משמעותית מזה שבטיפול ללא האכלה. בהשוואה לטיפול ללא הזנה, היחס בין מולקולות PS VII (M+2) /M− בעלים גדל משמעותית תחת טיפולי הזנה של עלים וגבעול-כלי דם. במקביל, בהשוואה לטיפול ללא הזנה, היחס בין מולקולות PS VII (M+2) / M בעלים תחת טיפול קנה שורש לא הראה הבדל משמעותי. יתר על כן, היחס בין מולקולות PS VII (M+2) / M בגזע, בשורש וקנה השורש לא הראה הבדלים בין ארבעת הטיפולים. בהשוואה לטיפול ללא האכלה, היחס בין מולקולת Paris saponin II (PS II) (M+2) /M בעלים תחת טיפול הזנת עלים לא הראה הבדל משמעותי, והיחס (M+3) /M של מולקולות PS II בעלים תחת טיפול הזנת עלים היה נמוך יותר. הנתונים אישרו כי האיבר העיקרי לסינתזה של PS VII הוא העלים. הוא מניח את הבסיס לזיהוי עתידי של האיברים והמסלולים העיקריים המעורבים בסינתזה של מטבוליטים משניים בצמחי מרפא.

Introduction

המסלולים הביוסינתטיים של מטבוליטים שניוניים בצמחים הם מורכבים ומגוונים, וכוללים איברי צבירה ספציפיים ומגוונים מאוד1. כיום, אתרי הסינתזה הספציפיים והאיברים האחראים למטבוליטים שניוניים בצמחי מרפא רבים אינם מוגדרים היטב. עמימות זו מציבה מכשול משמעותי לקידום אסטרטגי וליישום של שיטות גידול שנועדו לייעל הן את התשואה והן את האיכות של חומרי מרפא.

ביולוגיה מולקולרית, ביוכימיה וטכניקות תיוג איזוטופים נמצאות בשימוש נרחב כדי לפענח את מסלולי הסינתזה והאתרים של מטבוליטים שניוניים בצמחי מרפא 2,3,4,5, וכל אחת מהמתודולוגיות הללו מציגה חוזקות ומגבלות ייחודיות, כגון הבדלים ביעילות ובדיוק. גישות ביולוגיה מולקולרית, למשל, מציעות דיוק גבוה באיתור האתרים בתוך מסלולים ביוסינתטיים, אך הן גוזלות זמן רב. התועלת שלהם מוגבלת עוד יותר עבור מינים שאין להם רצפים גנומיים זמינים לציבור, מה שהופך את הטכניקות האלה לפחות מעשיות במקרים כאלה6. לעומת זאת, טכניקות תיוג איזוטופים, המשתמשות ביחסים איזוטופיים כמו 3C/12C, 2H/1H ו-18O/16O, מספקות אמצעי מהיר ונגיש לחקור את מנגנוני הסינתזה, ההובלה והאחסון של מטבוליטים שניוניים 7,8. הם יכולים לחשוף את הפיזור המרחבי של תרכובות אורגניות ואיזוטופים יציבים בעלים, ובכך לאפשר שחזור של תנאי הסביבה שחווים העלים לאורך מחזור חייהם9. יתר על כן, היישום של תוויות איזוטופיות חיצוניות, כגון 13C6-גלוקוז 10 ו 13C 6-פנילאלנין 11, מאפשר יצירת מטבוליטים משניים המסומנים בפחמן, ומשפר את הבנתנו את ייצורם ותפקודם.

טכניקות מסורתיות לסימון איזוטופים של פחמן נתקלות באתגרים באיתור האיברים הספציפיים האחראים לסינתזה של מטבוליטים שניוניים בשל האופי הספציפי מאוד למין של המסלולים הביוסינתטיים ומנגנוני ההובלה שלהם. ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית (LC-MS) עלתה לגדולה ככלי אנליטי מרכזי בזירה זו, המציע שיטה איתנה למעקב אחר איזוטופים אקסוגניים בסינתזה כימית של תרופות וחקירת תהליכים in vivo כגון ספיגה, חלוקה, מטבוליזם והפרשה12. הרגישות, הישירות והאמינות המעולות של LC-MS הופכות אותו לבחירה אידיאלית לניטור הייצור של מטבוליטים משניים בצמחים13. בתקופה האחרונה, LC-MS הפך מועדף יותר ויותר עבור היישום שלה בטכניקות תיוג איזוטופים חיצוניים, המאפשר הערכה של יעילות התיוג על פני דגימות שונות. מתודולוגיה זו מספקת תובנות קריטיות לגבי האיברים הראשוניים העוסקים בסינתזה של מטבוליטים שניוניים בצמחי מרפא, ומשמשת כהשלמה שלא תסולא בפז לשיטות ביולוגיות לזיהוי איברי הסינתזה של תרכובות אלה14,15. כתוצאה מכך, גישה זו לא רק מאפשרת השוואה של יעילות התיוג בין דגימות שונות, אלא גם שופכת אור על איברי המפתח המעורבים ביצירת מטבוליטים שניוניים של צמחים, ובכך משפרת את הבנתנו את הביוסינתזה שלהם.

הצגנו שיטה חדשנית המשלבת סימון איזוטופים של פחמן עם זיהוי LC-MS כדי לזהות את האיברים העיקריים האחראים לסינתזה של מטבוליטים משניים בצמחי מרפא. פריז saponin (PS) יש מגוון רחב של פעילויות פרמקולוגיות כגון אנטי סרטן, אימונומודולציה, ואנטי דלקת16, ו PPY הוא ביקוש גובר17. לכן, השתמשנו בשתילי PPY כנושאי מחקר, ופענחנו שהעלים הם האיבר העיקרי לסנתז את ה-Paris saponin VII (PS VII) (איור 1B) באמצעות תיוג 13C 6-Glucose הקשור לשיטת LC-MS. הגישה שלנו כללה ארבעה טיפולים שונים הכוללים הזנה של 13C6-Glucose לעלים, קני שורש וצרורות גזע-כלי דם, כמו גם בקרת אי-הזנה. הבחירה של 13C6-גלוקוז היא אסטרטגית, כפי שהוא מטבוליזם במהירות לתוך קואנזים אצטיל A באמצעות נשימה, אשר לאחר מכן מקל על סינתזת PS. תוך שימוש בשפע הטבעי של 13C, השתמשנו במערכת ספקטרומטר מסה של יחס איזוטופים יציב לכרומטוגרפיה של גז (GC-IRMS) כדי להעריך את יחסי 13C/12C בין איברי צמח שונים ולנתח את יחסי שיא היונים האיזוטופיים במולקולות PS VII ו-Paris saponins II (PS II) (איור 1B). המתודולוגיה שלנו, הממנפת 13מבשרי מטבוליטים משניים צמחיים המסומנים בתווית C וטכניקות ספקטרומטריית מסות חדשניות, מציעה חלופה פשוטה ומדויקת יותר לשיטות סימון איזוטופים פחמן קונבנציונליות. גישה חדשנית זו לא רק מעמיקה את הבנתנו את האיברים המעורבים בסינתזת מטבוליטים שניונית בצמחי מרפא, אלא גם מניחה בסיס מוצק למחקרים עתידיים במסלולים הביוסינתטיים של תרכובות אלה.

Protocol

1. הכנה ניסיונית ודא כי במהלך גידול הצמח, הלחות היחסית של החממה היא 75%, טמפרטורות היום / לילה הם 20 °C / 10 °C (75 °F), תקופת הצילום מורכבת מ 12 שעות ביום ו 12 שעות בלילה, ואת עוצמת האור היא 100 μmol·m-2·s-1. מספקים קרינה באמצעות מנורות דיודה פולטות אור (LED), תוך שמירה על מרחק של 30 ס”מ ב?…

Representative Results

כדי לאשר שאספקת 13C6-גלוקוז בקני שורש הייתה מוצלחת, ניתחנו עוד יותר את יחסי האיזוטופים של 13C/12C בקני שורש. יחסי האיזוטופים של 13C /12C בטיפולים 3 ו-4 היו גבוהים בהרבה מאלה של טיפול 2 (איור 1A). התוצאות הצביעו על כך ש-13C,6-גלוקוז מטיפול 3 ו-4 ?…

Discussion

היישום המוצלח של פרוטוקול זה תלוי במחקר מקיף של תכונות פיזיולוגיות של צמחים, רקמות, איברים ומטבוליטים משניים. גישת התכנון הניסויי המתוארת בפרוטוקול מניחה בסיס איתן לחקר המסלולים הביוסינתטיים של מטבוליטים שניוניים צמחיים. הגורמים הקריטיים בניסוי זה הם: (1) קביעת גיל השתילים הרב-שנתיים ו-(2) …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של תוכנית הנוער של סין (מס ‘82304670).

Materials

0.1 % Formic acid water Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory 44890
13C6-Glucose powder MERCK 110187-42-3
Acetonitrile Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory 44890
AUTOSAMPLER VIALS Biosharp Biotechnology Company 44866
BEH C18 column Waters,Milfor,MA 1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleaner Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software Thermo Scientific, Fremont,CA 3
Compound DiscovererTM  software  Thermo Scientific,Fremont,CA 3
Electric constant temperature blast drying oven DHG-9146A
Electronic analytical balance Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd SOP
Ethanol  Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory 44955
Fully automatic sample rapid grinder Shanghai Jingxin Technology Tissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer Thermo Fisher Delta V Advantage
Hoagland solution Sigma-Aldrich H2295-1L
Hydroponic tank JRD 1020421
Isodat software Thermo Fisher Scientific 3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry Agilent Technology  Agilent 1260 -6120 
Nitrogen manufacturing instrument PEAK SCIENTIFIC Genius SQ 24
Organic phase filter Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd 44890
Oxygen pump Magic Dragon MFL
Quantum sensor Highpoint UPRtek
Scalpel Handskit 11-23
Sprinkling can CHUSHI WJ-001
Xcalibur  software Thermo Fisher Scientific 4.2

References

  1. Erb, M., Kliebenstein, D. J. Plant secondary metabolites as defenses, regulators, and primary metabolites: The blurred functional trichotomy. Plant Physiol. 184 (1), 39-52 (2020).
  2. Li, Y., Kong, D., Fu, Y., Sussman, M. R., Wu, H. The effect of developmental and environmental factors on secondary metabolites in medicinal plants. Plant Physiol Biochem. 148, 80-89 (2020).
  3. Liu, S., et al. Genetic and molecular dissection of ginseng (panax ginseng mey.) germplasm using high-density genic snp markers, secondary metabolites, and gene expressions. Front Plant Sci. 14, 1165349 (2023).
  4. Chen, X., Wang, Y., Zhao, H., Fu, X., Fang, S. Localization and dynamic change of saponins in cyclocarya paliurus (batal.) iljinskaja. PloS One. 14 (10), e0223421 (2019).
  5. Yuan, M., et al. Ex vivo and in vivo stable isotope labelling of central carbon metabolism and related pathways with analysis by lc-ms/ms. Nat Protoc. 14 (2), 313-330 (2019).
  6. Cavalli, F. M. G., Bourgon, R., Vaquerizas, J. M., Luscombe, N. M. Specond: A method to detect condition-specific gene expression. Genome Biol. 12 (10), 101 (2011).
  7. Epron, D., et al. Pulse-labelling trees to study carbon allocation dynamics: A review of methods, current knowledge and future prospects. Tree Physiology. 32 (6), 776-798 (2012).
  8. Varman, A. M., He, L., You, L., Hollinshead, W., Tang, Y. J. Elucidation of intrinsic biosynthesis yields using 13c-based metabolism analysis. Microb Cell Fact. 13 (1), 42 (2014).
  9. Meng-Meng, G., Zhen-Yu, Z., Yu, Z., Qiu-Lin, Y., Ying, W. Systematic extraction and stable isotope determination of different biomarkers from single leaf of reticulate vein plants. Journal of Shaanxi University of Science & Technology. 41 (01), 72-79 (2023).
  10. Zhang, H., et al. A convenient lc-ms method for assessment of glucose kinetics in vivo with d-[13c6]glucose as a tracer. Clin Chem. 55 (3), 527-532 (2009).
  11. Chassy, A. W., Adams, D. O., Waterhouse, A. L. Tracing phenolic metabolism in vitis vinifera berries with 13c6-phenylalanine: Implication of an unidentified intermediate reservoir. J Agric Food Chem. 62 (11), 2321-2326 (2014).
  12. Lozac’h, F., et al. Evaluation of cams for 14c microtracer adme studies: Opportunities to change the current drug development paradigm. Bioanalysis. 10 (5), 321-339 (2018).
  13. Sulyok, M., Stadler, D., Steiner, D., Krska, R. Validation of an lc-ms/ms-based dilute-and-shoot approach for the quantification of > 500 mycotoxins and other secondary metabolites in food crops: Challenges and solutions. Anal Bioanal Chem. 412 (11), 2607-2620 (2020).
  14. Serra, F., et al. Inter-laboratory comparison of elemental analysis and gas chromatography combustion isotope ratio mass spectrometry (gc-c-irms). Part i: Delta13c measurements of selected compounds for the development of an isotopic grob-test. J Mass Spectrom. 42 (3), 361-369 (2007).
  15. Jung, J. -. Y., Oh, M. -. K. Isotope labeling pattern study of central carbon metabolites using gc/ms. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 101-108 (2015).
  16. Ding, Y. G., et al. The traditional uses, phytochemistry, and pharmacological properties of paris l. (liliaceae): A review. J Ethnopharmacol. 278, 114293 (2021).
  17. Cunningham, A. B., et al. Paris in the spring: A review of the trade, conservation and opportunities in the shift from wild harvest to cultivation of paris polyphylla (trilliaceae). J Ethnopharmacol. 222, 208-216 (2018).
  18. Madikizela, L. M., Ncube, S., Chimuka, L. Uptake of pharmaceuticals by plants grown under hydroponic conditions and natural occurring plant species: A review. Sci Total Environ. 636, 477-486 (2018).
  19. Tagami, K., Uchida, S. Online stable carbon isotope ratio measurement in formic acid, acetic acid, methanol and ethanol in water by high performance liquid chromatography-isotope ratio mass spectrometry. Anal Chim Acta. 614 (2), 165-172 (2008).
  20. Li, Y., et al. The combination of red and blue light increases the biomass and steroidal saponin contents of paris polyphylla var. Yunnanensis. Ind Crops Prod. 194, 116311 (2023).
  21. Wang, G., et al. Tissue distribution, metabolism and absorption of rhizoma paridis saponins in the rats. J Ethnopharmacoly. 273, 114038 (2021).
  22. Peng, S., et al. Progress in the study of differences in the types and contents of steroidal saponins in paris. Polyphylla smith var. Chinensis (franch.) hara. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 24 (05), 2014-2025 (2022).
  23. Alami, M. M., et al. The current developments in medicinal plant genomics enabled the diversification of secondary metabolites’ biosynthesis. Int J Mol Sci. 23 (24), 15932 (2022).
  24. Wen, F., et al. The synthesis of paris saponin vii mainly occurs in leaves and is promoted by light intensity. Front Plant Sci. 14, 1199215 (2023).
  25. Siadjeu, C., Pucker, B. Medicinal plant genomics. BMC Genomics. 24 (1), 429 (2023).
  26. Tian, C., et al. Top-down phenomics of arabidopsis thaliana: Metabolic profiling by one- and two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy and transcriptome analysis of albino mutants. J Biol Chem. 282 (25), 18532-18541 (2007).
  27. Masakapalli, S. K., et al. Metabolic flux phenotype of tobacco hairy roots engineered for increased geraniol production. Phytochemistry. 99, 73-85 (2014).
  28. Schwender, J., Ohlrogge, J. B., Shachar-Hill, Y. A flux model of glycolysis and the oxidative pentosephosphate pathway in developing brassica napus embryos. J Biol Chem. 278 (32), 29442-29453 (2003).

Play Video

Cite This Article
Chen, S., Chang, F., Lin, L., Wang, Y., Wen, F., Zhou, T., Pei, J. 13C6-Glucose Labeling Associated with LC-MS: Identification of Plant Primary Organs in Secondary Metabolite Synthesis. J. Vis. Exp. (205), e66578, doi:10.3791/66578 (2024).

View Video