Summary

Tek Yer Fıstığında (Arachis spp.) Aflatoksinlerin ve Stilbenoid Fitoaleksinlerin Tahribatsız SPE-UPLC Tabanlı Miktar Tayini Tohum

Published: April 19, 2024
doi:

Summary

Ultra performanslı sıvı kromatografisi kullanarak tek fıstık tohumlarında aflatoksinlerin ve stilbenoid fitoaleksinlerin miktar tayini için orta verimli bir yöntem gösteriyoruz. Bu yöntem, aflatoksijenik Aspergillus türleri tarafından zorlanan yabani Arachis türlerinin analizleri için özel olarak geliştirilmiştir.

Abstract

Aflatoksinler, başta Aspergillus flavus olmak üzere bazı mantar türlerinin oldukça kanserojen ikincil metabolitleridir. Aflatoksinler genellikle yer fıstığı da dahil olmak üzere ekonomik açıdan önemli tarımsal ürünleri kirleterek insan ve hayvan sağlığı için yüksek risk oluşturur. Dar genetik taban nedeniyle, yer fıstığı çeşitleri mantar patojenlerine karşı sınırlı direnç gösterir. Bu nedenle, Aspergillus’a toleransı olan çok sayıda yabani fıstık türü, bilim adamları tarafından hastalık direnci kaynakları olarak önemli ölçüde dikkate alınmıştır.

Aflatoksinlere direnç için bitki germplazmını araştırmak zordur, çünkü aflatoksin birikimi normal bir dağılım izlemez, bu da binlerce tek fıstık tohumunun analizine duyulan ihtiyacı belirler. Yeterince hidratlı yer fıstığı (Arachis spp.) tohumları, Aspergillus türleri tarafından enfekte edildiğinde, savunma fitoaleksinleri olarak kabul edilen biyolojik olarak aktif stilbenler (stilbenoidler) üretebilir. Yer fıstığı stilbenleri mantar gelişimini ve aflatoksin üretimini engeller. Bu nedenle, Aspergillus istilasına karşı tohum direncinin/duyarlılığının doğasını açıklamak için yer fıstığı stilbenoidleri için aynı tohumları analiz etmek çok önemlidir. Yayınlanan yöntemlerin hiçbiri aflatoksinler ve/veya stilben fitoaleksinler için tek tohum analizleri sunmamaktadır.

Çevre dostu, ucuz sarf malzemeleri kullanan, hassas ve seçici olan böyle bir yönteme olan talebi karşılamaya çalıştık. Ek olarak, yöntem tohumun sadece yarısını kullandığı ve embriyonik ekseni içeren diğer yarısını sağlam bıraktığı için tahribatsızdır. Böyle bir teknik, yer fıstığı bitkisinin çimlenmesine ve büyümesine, aflatoksin ve stilbenoid analizi için kullanılan aynı tohumdan tam olgunluğa izin verir. Bu yöntemin entegre kısmı olan Aspergillus ile tohumların manuel olarak zorlanması, yöntemdeki diğer adımlara göre daha fazla zaman ve emek gerektiren sınırlayıcı bir adımdır. Yöntem, Aspergillus’a dirençli türleri tanımlamak ve bu mantar patojenine karşı yeni genetik direnç kaynaklarını belirlemek ve karakterize etmek için yabani Arachis germplazmının araştırılması için kullanılmıştır.

Introduction

Yer fıstığı (Arachis hypogaea L.), dünyanın en önemli gıda ürünlerinden biridir. 100’den fazla ülkede yetiştirilmekte ve toplam üretimi 45 milyon tonu aşmaktadır1. Yer fıstığı, mısır ve pamuk tohumu gibi tarımsal ürünler genellikle aflatoksin üreten toprak kaynaklı mantarlar olan Aspergillus türleri tarafından istila edilir2. Bu ürünler, çevresel koşullar yüksek sıcaklıklar ve kuraklık ile karakterize edildiğinde, hasat öncesi aflatoksin kontaminasyonuna karşı özellikle hassastır. Aflatoksinler bilinen en güçlü kanserojenler arasındadır3. Dünyadaki tarımsal emtiaların dörtte birinikirletiyorlar 4 ve dünya nüfusunun yaklaşık yarısını kronik olarak aflatoksinlere maruz bırakıyorlar5. Yüksek kanserojenlikleri ve toksisiteleri nedeniyle, gıdalardaki aflatoksin varlığı, dünyanın çoğu ülkesinde pratik olarak kabul edilebilir en düşük sınırlarda düzenlenmektedir6.

Avrupa Birliği (AB), insani tüketim ürünlerindeki aflatoksin B1 için maksimum 2 ng/g ve toplam aflatoksinler (B1, B2, G1 ve G2) için maksimum 4 ng/g seviyesini yasalaştırmıştır7. Bu tür düşük limitler, aflatoksinlerle kontamine olmuş malları işleyen tarım ve gıda endüstrisi üzerinde önemli bir baskı oluşturmaktadır. Kontamine yer fıstığının aflatoksin izlemesi ve yeniden işlenmesi, aflatoksinlerin gıda zincirine girmesini önlemek için pasif ve maliyetli bir strateji olarak kabul edilebilir. Bu nedenle, yer fıstığı endüstrisinin tüm büyük segmentleri, genellikle mantar hastalıklarına karşı sınırlı direnç gösteren mevcut yer fıstığı çeşitlerinin aflatoksin kontaminasyonu nedeniyle muazzam kar kayıpları yaşamaktadır. Aflatoksin problemini çözmek için ileriye dönük bir yaklaşım, gen introgresyonu yoluyla mantara dirençli yer fıstığı çeşitlerinin elde edilmesi, yani genetik bilginin dirençli yabani yer fıstığı türlerinden elit çeşitlere aktarılmasıdır. Son yıllarda 8,9, yabani yer fıstığı türleri, genetik hastalık direncinin kaynakları olarak önemli ölçüde dikkate alınmıştır, çünkü kültür yer fıstığının dar genetik tabanı artık yer fıstığı bitkisine ihtiyaç duyulan direnç özelliklerini sağlayamamaktadır10,11. Yabani yer fıstığı türlerinden başarılı bir şekilde introgresyon, binlerce tek, küçük ve kıt tohumun analizini gerektirir (Şekil 1A) 12.

Figure 1
Şekil 1: Tek tohum analizi akış şeması. (A) Farklı pazar tipi yer fıstığı çeşitlerinin karşılaştırmalı büyüklüğü ile yabani Arachis spp. (1) Virginia; (2) koşucu; (3) İspanyolca; (4) yabani Arachis spp. (B) Yabani Arachis spp. (levha A, tohum 4) üç bölüme ayrılmış, (5) embriyonik eksenli yarım tohum; Tohumun bu kısmı bir bitki yetiştirmek için kullanılır (E). (C) (6) ve (7) numaralı parçalar bir matkap ucu ile delinir ve (D) mantar sporları ile aşılanır. 30 °C’de 72 saat inkübasyondan sonra, tohum parçalarından biri (6) veya (7) aflatoksin ve fitoaleksin analizleri için, diğeri ise RNA/transkriptom dizilimi için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Mantar patojenlerine karşı yer fıstığı direnci, fitoaleksinler 13,14,15,16,17 ile güçlü bir şekilde ilişkilidir. Yer fıstığı fitoaleksinleri, ekzojen uyaranlara, özellikle mantar istilasına maruz kaldıktan sonra bitki dokularında biyosentezlenen ve biriken antimikrobiyal stilbenoidler ile temsil edilir 16,17,18. Mantar istilası bölgesinde yeterli konsantrasyonda fitoaleksin birikimi mantar büyümesini engeller ve bitki savunması için kritik öneme sahiptir 19,20,21. Fitoaleksinler inhibitör konsantrasyonlara(16,22) biriktiğinde patojen büyümeyi durdurur. Yer fıstığında aflatoksijenik mantarlara karşı savunma bileşikleri olarak stilbenoidlerin rolü, 30 yılı aşkın bir süre önce saha deneylerindedeğerlendirildi 13. Bu deneyler, yer fıstığı stilbenoidlerinin hasat öncesi aflatoksin kontaminasyonunda çok önemli bir direnç faktörü olduğu hipotezini açıkça destekledi. Bu tür kanıtlar, stilbenlerin tarlada zarar görmüş yer fıstığında doğal olarak üretildiği gerçeğine dayanmaktadır; stilbenler, aflatoksijenik mantarlara karşı kayda değer biyolojik aktivite gösterir; Tohumlardaki aflatoksin kontaminasyonu, yalnızca yer fıstığı kuraklığa bağlı tohum dehidrasyonu nedeniyle fitoaleksin sentezi kapasitesini kaybettiğinde tespit edildi. Başka bir saha deneyi seti, fitoaleksin üretimi ile tarımsal açıdan önemli yer fıstığı hastalıklarına karşı yer fıstığı genotip direnci arasındaki ilişkiyi doğruladı17.

Mantar istilasına karşı yer fıstığı direncinin doğal fitoaleksin bazlı mekanizmasının daha iyi anlaşılması, aflatoksin kontaminasyonunun kontrolü için umut verici bir stratejidir 15,17.Bu nedenle, aflatoksin analizlerine ek olarak, aynı tohumların fitoaleksinler için kantitatif olarak analiz edilmesi önemlidir. Bu direnç mekanizması tam olarak araştırılmamış ve anlaşılmamış olsa da, mantara dayanıklı yeni çeşitler için yer fıstığı bitkilerinin ıslahı ve genetik olarak değiştirilmesi için çok önemlidir23. Farklı ürünlerde aflatoksin tayini için çeşitli analitik prosedürlerin varlığına rağmen, özellikle geleneksel yöntemlerin analitik ve maliyet etkin gereksinimleri karşılamadığı durumlarda, belirli araştırmalar için hala basit yöntemlere ihtiyaç vardır. Yer fıstığı endüstrisi, tarım ve özel laboratuvarlar tarafından kullanılan modern temizleme yöntemlerinin çoğu antikor bazlı24 ve immünoassay 25,26,27 cihazlarıdır. Seçici ve hassastırlar, ancak yaygın adsorbanlarla dolu mini sütunlardan önemli ölçüde daha pahalıdırlar. Ek olarak, bu yöntemlerin hiçbiri birkaç miligram ağırlığındaki numunelerin analizi için tasarlanmamıştır. Magnezyum silika jel (Florisil) ile paketlenmiş mini kolonların28 analitik kullanımına ilişkin önceki araştırmamıza dayanarak, bu prosedürü devam eden ve ileriye dönük ön ıslah ve ıslah programlarının ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirdik.

Bu çalışmanın amacı, tek yer fıstığı tohumlarında aflatoksinlerin ve fitoaleksinlerin kantitatif tayini için tahribatsız, orta verimli, çevre dostu bir yöntem geliştirmekti. Böyle bir yöntem geliştirilmiştir. Yayınlanmış yöntemlere göre avantajları, daha yüksek hassasiyet, aflatoksinleri ve fitoaleksinleri tek tohum ekstraktında analiz etme yeteneği, numuneleri tartma ihtiyacının olmaması ve daha küçük hacimli sarf malzemeleri sayesinde daha düşük maliyettir. Entegre yöntemin akış şeması Şekil 1’de gösterilmiştir. Genetik analizler ve diğer adımlar bu metinde belirtilmiş ve önerilen yöntemin önemini ve tüm prosedürle nasıl entegre edildiğini göstermek için şekilde gösterilmiştir.

Protocol

1. Mantar mücadelesi için tohumların hazırlanması Aflatoksijenik Aspergillus flavus NRRL 3357’yi bir test tüpünde 30 ° C’de 6 gün boyunca eğimli bir Patates Dekstroz Agar (PDA) üzerinde inkübe edin. Tween 20 (1 L damıtılmış steril suda 100 μL Tween) ile 10 mL su ile test tüpünden mantar sporlarını hasat edin, bir huniye yerleştirilmiş cam yününden süzün ve sporları kullanım kılavuzuna bakarak bir hemositometre ile sayın. Spor süspansiyonunu steril su ile 1.000 spor / μL konsantrasyonuna seyreltin. Konsantrasyonu bir hemositometre ile onaylayın.NOT: Spor süspansiyonunu zorlu deneylerden en geç 2 saat önce hazırlayın. Fıstık kabuklarını yavaşça kırın ve kabuklarını çıkarın. Tohumları, tohum hacmi beher hacminin 1 / 5’ini geçmeyecek şekilde steril bir behere yerleştirin, beher hacminin yaklaşık% 70’ine% 0.05 hidrojen peroksit çözeltisi ekleyin ve tohumların 3 saat boyunca su emmesine izin verin. Hidrojen peroksit çözeltisini tohumlardan boşaltın ve tohumları kaplamak için behere yaklaşık 3 kat daha fazla etanol-su karışımı (h/h) ekleyin. 1 dakika bekletin ve ardından tohumları 2 kez eşit hacimde steril damıtılmış su ile durulayın. Etanol ile sterilize edilmiş tohumlarla behere 5 kat hacimde% 3 hidrojen peroksit ekleyin ve 5 dakika bekletin, ardından sıvıyı boşaltın ve tohumları eşit hacimlerde steril su ile iki kez durulayın (Şekil 2A). Şekil 2: Aflatoksin ve fitoaleksin fraksiyonlarının aşılanması, inkübasyonu ve ekstraksiyonu için yer fıstığı tohumlarının hazırlanması. (A) Emilmiş tohumların %3 hidrojen peroksit ile sterilize edilmesi; (B) tohumlardan testa (deri) çıkarmak; (C) embriyonik eksen parçasının kesilmesi; (D,E) bir matkap ucu ile yarım kotiledonda delme boşluğu; (F) delinmiş tohum parçalarını agar üzerine yerleştirmek; (G) delinmiş boşluğa mantar sporları uygulamak. (H) Kuluçka sonrası tohumlu petri kabı; (I) inkübe edilmiş tek tohumların (kontrol numunelerinin fotoğrafı) güçlendirilmiş boncuk tüplerine yerleştirilmesi; (J) ölçülen hacimde ekstraksiyon çözücüsünün eklenmesi; (K) numunelerin bir boncuk parçalayıcıda toz haline getirilmesi; (L) toz haline getirilmiş bulamacın santrifüjlenmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Tohumları steril bir kağıt havlu üzerine koyun, forseps ile tohum testasını çıkarın ve embriyonik ekseni içeren tohumun yaklaşık 1/3’ünü neşter ile kesin (Şekil 2B,C). Tohumun bu kısmını atın veya büyüme ortamı olan bir test tüpünde bir bitki yetiştirmek için kullanın (Şekil 1B, E). Tohumun kalan kısmını iki kotiledona bölün, bir Petri kabına koyun, tohum parçalarını nemli steril filtre kağıdı ile örtün, dehidrasyonu önlemek için kapağı değiştirin ve hemen aşılama adımına geçin. Zorlu deneyleri gerçekleştirmeden önce, 100 x 15 mm’lik tabaklara 26 mL %1,5 steril agar suya dökerek tohum kuluçka ortamı ile yeterli sayıda Petri kabı hazırlayın ve gece boyunca katılaşmalarına izin verin. Kalan her bir kotiledonun dış tarafının ortasında, tohumu 1,6-2,34 mm çapında steril keskin bir matkap ucu ile manuel olarak delerek 1,5-2 mm derinliğinde bir boşluk açın. Bir boşluk oluşturmak ~ 2-5 s sürer (Şekil 2D, E). 4 ila 6 “delinmiş” tohum parçasını agar ile bir Petri kabına yerleştirin ve 10 μL’lik bir pipetleyici ile her yarım kotiledon parçasının delinmiş boşluğuna 2 μL 1.000 spor/μL süspansiyon uygulayın. Spor süspansiyonu yerine, kontrol tohumlarına steril su uygulayın (Şekil 2F,G). Tüm Petri kaplarını kapaklarla kapatın ve 30 °C’de ışıksız olarak 72 saat inkübe edin. 2. Kuluçkaya yatırılan tohum parçalarından numune alınması ve aflatoksin ve fitoaleksin analizleri için hazırlanması Tohum parçalarını forseps ile agardan çıkararak ve her birini 13 zirkonyum seramik boncuklu (12 tanesi 2,8 mm çapında ve 1 tanesi 6,5 mm çapında) etiketli 7 mL’lik boncuk şişelerine yerleştirerek 72 saatte toplayın (Şekil 2H,I).NOT: Bu noktada, hemen işlenmezse, şişeler -80 °C’lik bir dondurucuya yerleştirilebilir ve daha fazla işlemden önce 2 aya kadar saklanabilir. Fitoaleksinler ve aflatoksinler aynı tohum ekstraktında belirlenir. Ekstraksiyon için, görsel tohum boyutuna (küçük, orta veya büyük) bağlı olarak, boncuk şişelerine 2 veya 4 mL hassas bir şekilde ölçülen metanol-su karışımı (90:10, v/v) ekleyin ve 45 saniye boyunca 5,5 m/sn’de toz haline getirin. Toz haline getirilmiş tohumlu şişeleri bir santrifüje koyun ve 3 dakika boyunca 1.860 × g’da santrifüjleyin (Şekil 2J – L).NOT: Aşağıdaki önemli17,22 stilbenoid türevleri belirlenmiştir (tümü trans-konfigürasyonda): resveratrol, araşidin-1, araşidin-2, araşidin-3, 3′-izopentadienil-3,5,4′-trihidroksistilben (IPD) ve SB-1. Aflatoksin analizleri için, zorlu deneyleri çalıştırmadan önce, aşağıdaki gibi yeterli sayıda temizleme sütunu hazırlayın. Eşleşen bir polietilen gözenekli (20 μL) frit, 90° ‘lik bir açıyla kesilmiş bir cam çubuk yardımıyla 1,5 mL’lik bir polipropilen kolona yerleştirin. 50 mg magnezyum silika jeli (100-200 göz) özel yapım bir kepçe ile sütuna yerleştirin ve sütunu bir cam çubukla aşağı iterek aynı frit ile kapatın (Şekil 3A – E).NOT: Bu miktarda magnezyum silika jel 75 μL hacim kaplar ve adsorban tabakasının yüksekliği 3 mm’dir. Şekil 3: Temizleme kolonlarının ve filtrelerin hazırlanması. (A,B) Gözenekli bir fritin namluya yerleştirilmesi; (C, D) magnezyum silika jel ile doldurma varil; (E) adsorbanı paketlemek ve üst gözenekli bir fritin namluya yerleştirilmesi. (F) Bir Pasteur pipetinin üzerine 11,5 mm çapında bir cam elyaf daire yerleştirin. (G,H) Dairenin merkezini plastik veya tahta bir çubukla Pasteur pipet haznesinin dibine kadar itin ve cam elyafını sıkıca sıkıştırın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Bu noktada, Şekil 3F – H’de gösterildiği gibi eşleşen sayıda ısmarlama filtre hazırlayın. Aflatoksin analizleri için, süpernatantın 0,5 mL’ye kadar alikotunu hassas bir şekilde ölçün (adım 2.2’de açıklandığı gibi elde edilir), bunu özel olarak paketlenmiş mini sütuna aktarın ve ekstraktın yerçekimi ile 4 mL’lik bir cam şişeye akmasına izin verin. 1.0 mL metanol-su (90:10, v/v) karışımını kolona aktarın ve yerçekimi ile safsızlıkları aynı 4 mL şişeye yıkayın (Şekil 4A). Şekil 4: Tohum ekstraktlarının saflaştırılması ve UPLC analizleri için hazırlanması. (A) Paketlenmiş sütunlara sahip raf. (B) Temizleme kolonlarından ayrıştırılmış saflaştırılmış ekstrakt ile altı adet 4 mL’lik şişedenN2 gazı ile buharlaştırıcı çözücü. (C) 4 mL’lik şişelere enjeksiyon çözücüsü (MeOH-H2O 9: 1, v / v) eklenmeden önce ve sonra buzlu köpük kaplarda (1 ve 2) şişelerin ve filtrelerin sıfırın altındaki bir sıcaklığa getirilmesi. (D) Soğutulmuş ekstraktın 4 mL’lik bir şişeden 400 μL’lik bir otomatik örnekleyici şişesine filtrelenmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Kombine elüatları atın. Aflatoksin fraksiyonunu kolondan yerçekimi ile 1.2 mL aseton-asetonitril-su- formik asit (65:31:3.5:0.5, h/h) karışımı ile 4 mL’lik temiz bir cam şişeye boşaltın (Şekil 4A). Alternatif olarak, 2.0 mL asetonitril-su- formik asit (96:3,5:0,5, h/h) karışımı ile kolondan aflatoksinleri elüte edin ve 2 μL’ye kadar elüatın bir alikotunu doğrudan ultra performanslı sıvı kromatografisi (UPLC) sistemine enjekte edin (çözücününN2 ile buharlaşması olmadan).NOT: Bu durumda, aflatoksinler için 10 kata kadar daha düşük kantitasyon limiti bekleyin; Vakaların çoğunda, bu tür bir hassasiyet düşüşü kabul edilebilir, çünkü zorlu tohumdaki aflatoksin konsantrasyonları genellikle yüksektir. Çözücüyü, 45 ° C’de ısıtılmış bir bloktaN2’lik bir akışta şişelerden çıkarın. Şişeyi kapatın ve bir sonraki adımda eklenen çözücünün buharlaşmasını en aza indirmek için 30-45 saniye boyunca kırılmış buz içeren bir kaba koyun. Özel yapım filtreleri tek kullanımlık test tüplerine yerleştirin ve filtrasyon sırasında solventin buharlaşmasını en aza indirmek için tüpleri başka bir kaptaki buza yerleştirin (Şekil 4B,C). Çözücünün buharlaşmasından sonra, kuru kalıntıyı hassas bir şekilde ölçülen 0.25-1.0 mL metanol-su karışımında (90:10, v/v) çözün ve 1-2 saniye boyunca girdap yapın. Saflaştırılmış ekstraktlar içeren şişeleri UPLC otomatik numune alma cihazına yerleştirin ve UPLC sistemine 0.1 ila 3.0 μL enjekte edin (Şekil 5A,B).NOT: Girdaplamadan sonraki çözeltinin bazı asılı parçacıklara sahip olduğundan şüpheleniliyorsa, çözeltiyi soğutulmuş filtreden süzün (Şekil 4D). Şekil 5: Saflaştırılmış ekstraktların UPLC analizlerinin süreci ve sonuçları. (A) Saflaştırılmış numune ekstraktlarının bulunduğu bir rafın UPLC otomatik numune alma cihazına yerleştirilmesi. (B) Enstrümantal analizlerin yapılması, verilerin elde edilmesi ve sonuçların yorumlanması. (C) Dört ana aflatoksinin UPLC’si; İlgilenilen başlıca zirveler olan aflatoksinler B1 ve B2 sırasıyla 0.04 ve 0.004 ng’yi temsil eder. (D) Aflatoksinler B1 ve B2’nin UPLC’si, tepe 2, 2 pg seviyesinde (8 μL’lik bir akış hücresi ile) aflatoksin B1’i temsil eder. (E) Yabani bir Arachis türü ile yerel bir fıstık tarlasından hasat edilen bir tohumun saflaştırılmış ekstraktının UPLC’si. (F) Bazik bir alüminyum oksit mini kolon ile saflaştırılmış, zorlanmış bir fıstık tohumunun ekstraktının UPLC’si. (G) Bir Florisil sütunu ile saflaştırılmış meydan okunmuş fıstık tohumu ekstraktının UPLC’si; mavi kromatogram, kolondan 1 mL metanol-su (90:10 v/v) karışımı ile yıkanan safsızlıkları sunar; siyah kromatogram, aflatoksinler M1 ve B1’in zirvelerini gösterir. Aflatoksin B1 seviyesi 48 ng / g’dır. (H) Zorlu bir tohumdan elde edilen yer fıstığı stilbenoidlerinin tipik bir kromatogramı; kısaltma: IPD = 3′-izopentadienil-3,5,4’-trihidroksistilben. Not: Tohum ekstraktlarındaki tüm stilbenoidler trans-konfigürasyondadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.  Fitoaleksin analizleri için, her bir boncuk şişesinden 200 μL süpernatanı yukarıdaki Pasteur pipet filtresine aktarın. 2 μL’lik bir UPLC otomatik numune alma cihazı şişesine filtrasyonu hızlandırmak için sıkıştırılmış bir nitrojen tankından N400 gazı kullanın ve şişeyi bir PTFE septumlu uygun bir kapakla kapatın (Şekil 4D). 3. Aflatoksin analizleri Tohum ekstraktlarındaki aflatoksinlerin ayrılması için, bir otomatik numune alma cihazı, bir kuaterner pompa, bir floresan dedektörü, bir UPLC BEH C18 3,0 mm x 100 mm, eşleşen bir ön kolona sahip 1,7 μm kolon ve orijinal uzunluğunun ‘ine kadar kesilmiş 0,25 iç çapa sahip standart örme PTFE bobine sahip bir kolon sonrası fotokimyasal reaktör (PHRED) ile donatılmış bir UPLC sistemi kullanın.NOT: Yazarlar tarafından kullanılan UPLC cihazı ve ilgili ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Aşağıdaki gradyanda su (A), metanol (B) ve asetonitril (C) kullanın: başlangıç koşulları, .7 A, B, .3 C, doğrusal olarak 3.75 dakikada A, B, C olarak değiştirildi, 3.751 dakikada %0 A, .4 B, .6 C olarak değiştirildi, 3.249 dakika izokratik tutuldu, daha sonra 0.01 dakika içinde başlangıç koşullarına değiştirildi ve bir sonraki enjeksiyondan önce 2.499 dakika izokratik tutuldu. Akış hızını 0,45 mL/dk’ya ve çalışma süresini 9,5 dk’ya ayarlayın. Sistem kolon ısıtıcısında kolonu 40 °C’de tutun. Aflatoksinler B1, B2, G 1, G2 ve M1 miktar tayini için uyarma ve emisyon dalga boyları olarak sırasıyla 362 nm ve 440 nm kullanın. Majör aflatoksinlerin yapıları Şekil 6A’da gösterilmiştir.NOT: Deney koşulları altında, A. flavus NRRL 3357 tarafından yalnızca aflatoksinler B1 ve B2’nin üretilmesi beklenmektedir; tohum mücadelesi için bir A. parasiticus suşu kullanılırsa, aflatoksinler B1, B2, G1 ve G2 üretimi beklenir. Yazılım kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi ilgili otantik standartların (kalibrasyon eğrisi) tepe alanlarına atıfta bulunarak aflatoksin konsantrasyonlarını belirleyin.NOT: UPLC prosedürü, floresan dedektörü için yüksek hassasiyet ayarlarında temel gürültü gösterdiğinden, aflatoksinler için Algılama Limiti (LOD) ve Kantitasyon Limiti (LOQ), LOD için 3:1 ve LOQ için 10:1 olan yaygın olarak kabul edilen Sinyal-Gürültü oranı kullanılarak değerlendirilir. Bölüm 2 ve 3’te açıklanan yer fıstığı tohumu analizi için rutin deney düzeneğinde, aflatoksinler G1 ve B1 için kantitasyon sınırlarının, aflatoksinler G2 ve B2 için sırasıyla 0,8 ve 0,08 ng/g’ye eşit veya daha az olması beklenmektedir. 4. Stilbenoid fitoaleksin analizleri Stilbenoidlerin ayrılması için, aşağıdaki gradyanda su (A), metanol (B) ve% 88 formik asit (C) kullanın: başlangıç koşulları,% 53 A,% 42 B,% 5 C,% 35 A,% 60 B,% 5 C olarak değiştirildi 2.0 dakikada, 4 dakika boyunca izokratik tutuldu, 0.5 dakikada% 0 A,% 95 B,% 5 C olarak değiştirildi, 2.5 dakika boyunca izokratik tutuldu, Daha sonra 0.1 dakika içinde başlangıç koşullarına değiştirildi ve bir sonraki enjeksiyondan önce 2.9 dakika boyunca izokratik tutuldu. Akış hızını 0,5 mL/dk’ya ve çalışma süresini 12,0 dk’ya ayarlayın. Stilbenoidlerin konsantrasyonlarını, ilgili otantik standartların tepe alanlarına (kalibrasyon eğrisi) ve/veya yazılım kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi yayınlanmış molar sönme katsayılarına atıfta bulunarak belirleyin. Majör stilben türevi fitoaleksinlerin yapıları Şekil 6B’de gösterilmiştir.NOT: Fitoaleksinlerin ayrılması, aynı sistem kullanılarak, ancak bir floresan dedektörü ve bir PHRED reaktörü olmadan gerçekleştirilir. Bunun yerine, yer fıstığı stilbenoidlerinin tespiti ve miktarının belirlenmesi için bir Diyot Dizi Dedektörü kullanılır. Majör stilbenoid fitoaleksinler için Kantitasyon Limiti (LOQ), stilbenoid konsantrasyonları aynı ekstrakttaki aflatoksin konsantrasyonlarını bazı büyüklük sıralarına göre aştığından pratik bir anlama sahip değildir; 3 günlük inkübasyondan sonra, stilbenoidler güvenilir bir şekilde ölçülür.

Representative Results

Tohumlarda aflatoksin miktar tayini için geliştirilen yöntem, yabani yer fıstığı türlerinin aflatoksin birikimine direnç açısından değerlendirilmesi prosedürünün tamamının özüdür. Özel olarak paketlenmiş mini sütunlar ve filtreler, büyük hacimli solventlerin olmaması, maliyetli ve gereksiz 0,22 veya 0,45 μm ticari filtreler ve pompalama cihazları nedeniyle önemli ölçüde tasarruf sağlar ve genel prosedürü basitleştirir. Aflatoksin analizleri yöntemi, Tablo 1’de görüldüğü gibi öğütülmüş tohumlardan test edilen 1.0-50.0 ng/g aflatoksin aralığında yüksek geri kazanım, doğruluk ve hassasiyet sağlar. Yüksek derecede kontamine olmuş numuneler, doğrusal test edilen değere seyreltildi. Şekil 5C , dört ana aflatoksinin, B1, B2, G1 ve G2’nin 5 dakikalık elüsyon süresi içinde temel olarak ayrılmasını göstermektedir, bu da yer fıstığı tohumlarının mantar mücadelesi prosedürün sınırlayıcı aşaması olduğundan ve UPLC analizlerinden değil, kabul edilebilir. Önerilen yöntem, aflatoksin B1 için 2 pg’lik bir kantitasyon limiti ile yeterince hassastır (Şekil 5D). Ekstraktların yüksek saflığı, yabani bir Arachis türüne sahip bir tarladan hasat edilen saflaştırılmış tohum ekstraktının bir UPLC’sinden (Şekil 5E) görüldüğü gibi aflatoksinlerin kesin olarak ölçülmesine izin verir. Daha önce yayınlanmış bir mini sütun yöntemi29, önerilen yönteme (Şekil 5G) kıyasla mantarla mücadele edilen yer fıstığı tohumları (Şekil 5F) için tatmin edici saflık elde etme yeteneğine sahip değildir. Şekil 5F’den, aflatoksinler B2, G1 ve G2’nin, birçoğu aflatoksinlerden sonra ayrıştırılan stilbenoid fitoaleksinler ve mantar metabolitleri olan yüksek konsantrasyonlarda enterferans yapan safsızlıkların varlığı nedeniyle güvenilir bir şekilde tespit edilemediği ve miktarının belirlenemediği açıktır. Buna karşılık, Şekil 5G, magnezyum silika jel kolonunun aflatoksin fraksiyonundaki safsızlıkların giderilmesindeki yüksek verimliliğini göstermektedir. Mavi kromatogram, kolondan 1 mL metanol-su (90:10) karışımı ile yıkanan enterferans yapan safsızlıkları sunar; siyah kromatogram, aflatoksinler M1 ve B1’in gizlenmemiş zirvelerini gösterir. Bu kromatogram, zorlu bir yabani tür tohumunun ekstraktını temsil eder. Aflatoksin B1 seviyesi 48 ng/g’dır. Yer fıstığı fitoaleksinlerinin kantitasyonu, bir tarladan elde edilen doğal bir tohum veya mantarla mücadele eden bir tohum olabilen aynı tohumdaki aflatoksinlerin analizlerine değerli bir katkı sağlar. Şekil 5H, zorlu bir tohumdan elde edilen fıstık savunma stilbenoidlerinin tipik bir kromatogramını göstermektedir. Bileşiklerin ayrılması, aflatoksin analizleri için kullanılan aynı analitik kolon kullanılarak gerçekleştirilir. Kolon ve seçilen kromatografik koşullar, stilbenoidlerin güvenilir bir şekilde kantitasyonuna izin veren piklerin tatmin edici bir şekilde ayrılmasını sağlar. Sorunlu tohumlarda aflatoksin-fitoaleksin ilişkisinin değerlendirilmesi bu sunumun kapsamı dışındadır ve yöntem burada, yazarların laboratuvarında birkaç yıldır kullanılan ve yararlı olduğu kanıtlanmış potansiyel bir araştırma aracı olarak önerilmektedir. <!– Figure 1: Single-seed analysis flowchart. (A) Comparative size of different market-type peanut cultivars vs. wild Arachis spp. (1) Virginia; (2) runner; (3) Spanish; (4) wild Arachis spp. (B) Wild Arachis spp. seed 4 cut into three sections, (5) half seed with embryonic axis; this portion of the seed is used to grow a plant (E). (C) Parts (6) and (7) are drilled with a drill bit and (D) inoculated with fungal spores. After incubation for 72h at 30 oC, one of the seed parts, (6) or (7) is used for aflatoxin and phytoalexin analyses, and another is used for RNA/transcriptome sequencing. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 2: Preparation of peanut seeds for inoculation, incubation, and extraction of aflatoxin and phytoalexin fractions. (A) Sterilizing imbibed seeds with 3% hydrogen peroxide; (B) removing skins from seeds; (C) cutting off the embryonic axis part; (D,E) drilling cavity in a half cotyledon with a drill bit; (F) placing drilled parts of seeds on agar; (G) applying fungal spored into drilled cavity. (H) Petri dish with seeds after incubation; (I) placing incubated single seeds (photo of control samples) into beading vials; (J) adding measured volume of extracting solvent; (K) pulverizing samples in a bead raptor; ( L) centrifugation of pulverized slurry. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 3: Preparation of cleanup columns and filters. (A,B) Placing a porous frit into barrel; ( C,D) filling barrel with magnesium silica gel; (E) packing the adsorbent and inserting a top porous frit into barrel. (F) Placing an 11.5 mm dia. glass fiber circle on top of a Pasteur pipette. (G,H) Pushing the center of the circle with a plastic or wooden rod down to the bottom of the Pasteur pipette barrel and firmly compacting the glass fiber. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 4:Purification of seed extracts and preparation for the UPLC analyses. (A)Rack with packed columns. (B) Evaporating solvent with N2 gas from six 4 mL vials with purified extract eluted from cleanup columns. (C) Bringing vials and filters to a subzero temperature in foam containers (1 and 2) with ice before and after addition of the injection solvent (MeOH-H2O 9:1, v/v) to the 4-mL vials. (D) Filtering cooled extract from a 4-mL vial into a 400 µL autosampler vial. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 5: The process and results of UPLC analyses of purified extracts. (A) Placing a rack with purified sample extracts into UPLC autosampler. (B) Performing the instrumental analyses, obtaining data, and interpreting results. (C) UPLC of four major aflatoxins; the major peaks of interest, aflatoxins B1 and B2 represent 0.04 and 0.004 ng, respectively. (D) UPLC of aflatoxins B1 and B2; peak 2 represents aflatoxin B1 at a 2 pg level (with an 8 µL flow sell). (E) UPLCof purified extract of a seed harvested from a local peanut field with a wild Arachis species. (F) UPLC ofthe extract of a challenged peanut seed purified with a basic aluminum oxide minicolumn. (G)UPLC of the extract of challenged peanut seed purified with a Florisil column; blue chromatogram presents impurities that are washed from the column with 1 mL of methanol-water (90:10 v/v) mixture; black chromatogram shows peaks of aflatoxins M1 and B1. The level of aflatoxin B1 is 48 ng/g. (H) Atypical chromatogram of peanut stilbenoids from a challenged seed; abbreviation: IPD = 3′-isopentadienyl-3,5,4′-trihydroxystilbene. Note: All stilbenoids in seed extracts are in trans-configuration. Please click here to view a larger version of this figure. –> Şekil 6: Majör aflatoksinlerin ve stilben türevi yer fıstığı fitoaleksinlerinin yapıları. (A) Majör aflatoksinlerin yapıları: 1, B, 1; 2, B, 2; 3, G1; 4, G2. (B) Başlıca stilben türevi yer fıstığı fitoaleksinlerinin yapıları: 6, resveratrol; 7, Araşidin-1; 8, Araşidin-2; 9, Araşidin-3; 10, IPD (3 “-izopentadienil-3,5,4” -trihidroksistilben); 11, SB-1. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.  Spike seviyesia(ng/g) Aflatoksinler B1 B2 G1 G2 50 85.87 (0.97) 82.33 (0.67) 86.63 (2.89) 84.01 (0.86) 5 91.43 (2.76) 87.32 (0.47) 88.08 (2.08) 87.73 (0.77) 1 81.21 (3.16) 85.33 (1.98) 81.76 (4.66) 88.46 (3.24) Tablo 1: Florisil sütunu ve 1.2 mL aflatoksin fraksiyonu elüsyon karışımı kullanılarak yer fıstığı tohumlarından aflatoksinlerin geri kazanımı. [ortalama (SD), %; n = 5]. Georgia 06G yer fıstığı çeşidine ait aflatoksin içermeyen öğütülmüş numuneler (50 g), 50, 5 veya 1 ng/g seviyesinde aflatoksin stok çözeltisi içeren bir mikro şırınga yardımıyla eşit şekilde çivilenmiş ve oda sıcaklığında 16 saat bekletilmiştir . Aflatoksinler B1 ve G1 için ani değerler verilmiştir; aflatoksinlerB2 ve G2 için 0.33 çarpma faktörü kullanılmalıdır.

Discussion

Önceki deneyimlerimize28 dayanarak, Aspergillus’a dirençli türleri tanımlamak ve bu fırsatçı mantara karşı yeni genetik direnç kaynaklarını belirlemek ve karakterize etmek için yabani Arachis germplazm koleksiyonlarının araştırılması için uygun, basit, ucuz, çevre dostu, kimyasal bir prosedür geliştirdik. Bu yöntem, katı faz ekstraksiyonu (SPE) tekniği ile tohum ekstraktı saflaştırmasına ve Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi (UPLC) ile aflatoksin miktar tayinine dayanır ve yeterince yüksek geri kazanım, hassasiyet ve doğruluk ile karakterize edilir. Önerilen “Florisil” yöntemi, aflatoksinleri28 güçlü ve seçici bir şekilde tutmak için Florisil’in (magnezyum silika jel) benzersiz özelliğine dayanan tek mini sütun temizleme prosedürünün bir modifikasyonudur. Orijinal yöntemde olduğu gibi, tohum örnekleri MeOH-H2O karışımı ile ekstrakte edildi, ancak yayınlanan 80:20 (h / v) ile karşılaştırıldığında 90:10 (h / v) gibi farklı bir oranda. Bu değişiklik, aynı aflatoksin geri kazanım hızı ile solventlerin temizleme kolonundan akış hızını 2,5 kata kadar artırmıştır. Bu 90:10 (h/h) metanol-su karışımı, 1 g substratta 5-50 ng aflatoksin konsantrasyonlarına eşdeğer başak seviyelerinde ekstraksiyon çözücüsüne eklenen aflatoksinler B1, B2, G1 ve G2 standartlarının yaklaşık %100 geri kazanımını sağladı ve ayrıca çivili fıstık tohumu örneklerinden yeterince yüksek geri kazanımlar sağladı (Tablo 1).

Aflatoksinlerin Florisil adsorbandından sadece büyük hacimlerde aseton30, aseton-metanol31,32 ve aseton-su karışımları 33,34,35,36 ile ayrıştırılabileceği gösterilmiştir. Bu araştırma sırasında, asitleştirilmiş asetonitrilin, Florisil’den aflatoksinleri ayrıştırma kabiliyetinde asetona benzer şekilde davrandığını keşfettik. Bildiğimiz kadarıyla, asetonitrilin bu özelliği literatürde bildirilmemiştir. Bu özelliğin keşfi, saflaştırılmış ekstraktın doğrudan UPLC sistemine enjekte edilmesine izin verir, bu da hazırlama süresini önemli ölçüde azaltan solvent buharlaştırma adımını atlayabilir. Asetonitril aseton (aseton-asetonitril-su-%88 formik asit (65:31:3.5:0.5, h/v)) ile karıştırıldığında bile, saflaştırılmış elüatlardan suyun pürüzsüz, eksiksiz ve hızlı bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlayarak çözücü buharlaşma süresini önemli ölçüde azalttı. Asetonitrilin varlığı, iki ek yıkama çözücüsünün, metanol ve kloroform-metanol karışımının gerekli olduğu yayınlanmış bir yönteme kıyasla, Florisil kolonundaki safsızlıkları etkili bir şekilde gidermek için tek bir çözücü, metanol-su (90:10, v/h) karışımının kullanılmasına izin verdi. 28

Ortalama olarak, aflatoksinlerin elüsyonu için 1.2 mL kullanıldığında aflatoksin B1 standart geri kazanımı ~% 98 idi. 50 mg Florisil miktarı, 1.2 mL elüsyon çözücüsünün mini sütunu namlunun tepesine kadar doldurması ve aynı zamanda tatmin edici bir geri kazanım sağlaması için seçildi (Tablo 1). Bu yaklaşım, kolon varilinin yalnızca bir kez doldurulması gerektiğinden temizleme prosedürünü hızlandırır. Bu projenin ilk aşamalarında, nispeten büyük bir parçacık boyutuna, 100-200 ağa sahip ticari bir Florisil fraksiyonunun, adsorbanın sadece 3 mm’lik bir katmanını tutan küçük bir kolon için uygun olup olmayacağı açık değildi. Bu nedenle, ABD standart test elekleri 120-140, 140-170, 170-200, 200-270, 270-400 ve >400 mesh kullanılarak ticari 100-200 mesh ürününden elde edilen farklı Florisil fraksiyonlarını araştırdık. Tüm bu fraksiyonlar, tatmin edici bir geri kazanım ile tekrarlanabilir, neredeyse eşleşen sonuçlar sağladı. Daha küçük parçacık boyutu fraksiyonları, UV ışığı altında kolonda daha dar aflatoksin bantları göstermesine rağmen, bu fraksiyonlar, ticari 100-200 gözenekli üründen hiçbir şekilde üstün değildi. Ek olarak, 100-200 ağ fraksiyonu, tüm prosedür için en kısa elüsyon sürelerini (8-12 dakika) gösterdi.

Gradyan UPLC çözücü dağıtımı, aflatoksinlerin tatmin edici bir şekilde ayrılmasına ve ayrıca polar olmayan safsızlıkların kolondan tamamen uzaklaştırılmasına izin verdi (Şekil 5G). Bu yaklaşım, kusursuz kolon çalışmasına ve yüzlerce numunenin analizinin tekrarlanabilir sonuçlarına yol açtı. Florisil sütunundan çıkarılan aflatoksinlerin kimliği daha önce açıklandığı gibi doğrulandı. 28 Burada kullanılan 3 mm çaplı analitik UPLC kolonu, aynı kimyanın 2,1 mm çapındaki kolonuna kıyasla daha yüksek konsantrasyonlarda aflatoksinler B1, B2, G1 ve G2’nin daha yüksek seçicilik ve daha güvenilir bir şekilde ayrıldığını göstermiştir. Ayrıca, 3 mm’lik kolonun uzun ömürlülüğü (1.200’den fazla enjeksiyon), 2.1 mm’lik kolonun (800 enjeksiyona kadar) ömründen önemli ölçüde daha yüksekti. 3 mm’lik kolon daha yüksek bir mobil faz oranı (%40 daha fazla) gerektirse de, bu dezavantaj kolonun yukarıdaki avantajlarından daha iyi performans gösterdi.

Florisil mini kolonu, Aspergillus metabolitleri ile yoğun şekilde kontamine olmuş yer fıstığı tohumlarının ekstraktlarının saflaştırılması için etkiliydi (Şekil 5G); Bu tür tohumlar ayrıca mantar istilasına yanıt olarak tohumlar tarafından üretilen yüksek seviyelerde stilbenoid fitoaleksin içeriyordu. Tüm bu safsızlıklar, tohumlardaki aflatoksin konsantrasyonunu 106 kat22’ye kadar aşabilir ve bu da bu tohumları aflatoksin analizleri için zorlu nesneler haline getirir. Şekil 5G , aflatoksin tutma süreleri içinde kromatogramda enterferans yapan piklerin eksikliğini göstermektedir, bu da aflatoksin tespitini ve kantitasyonunu test edilen tüm seviyelerde tavizsiz hale getirmiştir (Tablo 1). Tablo 1’de görüldüğü gibi, yöntemin doğruluğu ve kesinliği, aynı zamanda aflatoksin tespiti için en kritik aralık olan test edilen 1.0-50.0 ng/g aralığında yeterince yüksekti. Çeşitli yabani fıstık genotipleri için farklı seviyelerdeki geri kazanımlar tekdüzeydi ve beş farklı ekstraksiyon için standart sapmalar esasen düşüktü.

Yöntem ayrıca, 10.000 ng / g’ın üzerinde toplam aflatoksinler içeren sıfırdan son derece yüksek seviyelere kadar doğal olarak kontamine olmuş yer fıstığı, pamuk, mısır ve pirinç tohumları üzerinde de test edildi. Mısır, pamuk tohumu ve pirinçten 5 ng/g düzeyinde aflatoksin B1, B2, G1 ve G2 geri kazanımı sırasıyla %76.1 ile %93.7, %77.1 ile %86.6 ve %90.5 ile %96.2 arasında değişmiştir. Pirinçten aflatoksinlerin en yüksek geri kazanımına, eluentin “saflığı”, yani neredeyse herhangi bir safsızlık eksikliği eşlik etti. Ayrıca, pirinç, ortalama olarak 19 mg / tohum test edilen en küçük tek nesneyi temsil etti.

Bir Florisil sütunu kullanılarak tek bir fıstık tohumu için (bombardıman, tartma, ekstraksiyon, santrifüjleme ve saflaştırma dahil) toplam hazırlama süresi 20 dakikayı geçmedi. Florisil mini sütununun maliyeti, ticari temizleme sütunlarından >10 kat daha azdır. Yayınlanan prosedüre kıyasla daha düşük hacimlerde adsorban, çözücü ve nitrojen gazı kullanılmasından ek tasarruf sağlanır28. Mini kolon, çalışması için pompalama veya vakum cihazları gerektirmez ve belirsiz bir raf ömrüne sahiptir.

Bitki germplazmını aflatoksinlere direnç açısından araştırmak son derece zordur çünkü mikotoksin birikimi normal bir dağılım izlemez37,38; Bu olgunun üstesinden gelmek için tek tohumlarda çok sayıda aflatoksin analizine ihtiyaç vardır. Aflatoksin içeriğinin yanı sıra, kantitatif fitoaleksin bileşimi ile ilgili bilgiler, tek bir tohumdan elde edilebilecek (Şekil 1A) ve belirli bir bitkiye kadar izlenebilecek (Şekil 1E) geniş bir bilgi birikimi ışığında oldukça değerlidir. Yöntem, arazi ırkları, gelişmiş ıslah hatları ve elit fıstık çeşitleri dahil olmak üzere yüzlerce katılımı taramak için başarıyla kullanılmıştır. Yöntem, yer fıstığı ön ıslah ve ıslah araştırma programlarında kullanılmak üzere önerilmektedir ve mantar direnci için yer fıstığı genlerinin karakterizasyonuna yardımcı olabilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, USDA-ARS CRIS projesi 6044-42000-011-00D ve CRIS projesi 6044-21000-005-000-D tarafından mali destek almıştır. Mini sütun tutma rafını yaptığı için Dan Todd’a teşekkür ederiz. Bu makalede ticari adlardan veya ticari ürünlerden bahsedilmesi, yalnızca belirli bilgiler sağlama amaçlıdır ve ABD Tarım Bakanlığı tarafından tavsiye veya onay verildiği anlamına gelmez.

Materials

Acetone, Optima Fisher Scientific A929-4
Acetonitrile, Optima Fisher Scientific A996-4
Acquity BEH C18 2.1 x 5mm Van-Guard pre-column Waters Corporation 186003975
Acquity BEH C18 3 x 100mm column Waters Corporation 186004661
Acquity BEH C18 2.1 x 100mm column Waters Corporation 186002352
Aflatoxins B1, B2, G1, and G2 Sigma-Aldrich A9441-1VL Dissolve the contents of the commercial vial in 5 mL of methanol to obtain 5 µg/mL for aflatoxins B1 and G1 and 1.5 µg/mL for B2 and G2
Aflatoxin B1 (1mg) Sigma-Aldrich A6636-1MG
Aflatoxin B2 (1mg) Sigma-Aldrich A9887-1MG
Aflatoxin G1 (1mg) Sigma-Aldrich A0138-1MG
Aflatoxin G2 (1mg) Sigma-Aldrich A0263-1MG
Aflatoxin M1 (10 µg) Sigma-Aldrich CRM46319
Agar, Granulated (2kg) Becton Dickinson BD214510
Alumina oxide basic (60-325 mesh) Fisher Scientific A941-500
Basal medium Murashige and Skoog M5519
Bead Ruptor 24  Omni International 19-042E
Beaker (1000mL) Corning (Pyrex) 10001L
Beaker (250mL) Corning (Pyrex) 1000250
Beaker (400mL) Corning (Pyrex) 1000400
Beaker (600mL) Corning (Pyrex) 1000600
Blade, scalpel Feather #10
Centrifuge (LSE Compact) Corning Model: 6755
Centrifuge, micro Corning Model: 6770
Ceramic beads (2.8 mm) Omni International 19-646
Ceramic beads (6.5 mm) Omni International 19-682
Chromeleon 7 series Software Thermo Scientific
Drill bit Kyocera 07896 1.6 mm
Drill bit Kyocera 07357 2.0 mm
Drill bit Kyocera 07985 2.34 mm
Ethanol (200 proof) Decon Labs 2805M
Evaporator, nitrogen organimation 11106 6-position
Excel, Microsoft Microsoft Office 365
Filter paper (#4) Cytiva Whatman 1004-090
Filter paper cutter, stainless steel (ID 11.5mm) Unknown
Filter paper, glass fibre Cytiva Whatman 934-AH
Flask (2800mL) Corning (Pyrex) 44202XL
Florisil (100-200 mesh) Fisher Scientific F101-500
Forceps Integra Lifescience (Miltex) PM-0300
Formic acid (88%, ACS) Fisher Scientific A118P-500
Freezer (-80oC) Fisher Scientific TSX70086D
Funnel (15 x 80mm) DWK Life Sciences (Kimax) 2902060
Gelzan (medium) Caisson Labs  G024
Glass rod (custom) Custom made
Glass wool Corning (Pyrex) 3950
Handle, scalpel  Feather #7
Hemocytometer Hausser Scientific 3100
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H325-4 30%, Certified ACS
Ice bucket, round with lid Corning 432122
Incubator Percival 136VL
Kimtech SCIENCE Brand Kimwipes Kimtech 34120 8.2" x 4.39"
Kimtech SCIENCE Brand Kimwipes Kimtech 34256 16.4" x 14.43"
Lab coat Cenmed B113660SBXL
Methanol, Optima Fisher Scientific A454-4
Mini column rack (custom) Custom made
Mixer, touch (maxi mix II) Thermolyne 37600 (model 231)
Nitrile gloves  Microflex XC310M
Nitrogen gas, compressed (ultra high purity) Jones Welding
Paper towel Georgia-Pacific 20023 (D400)
pH meter Fisher Scientific (Accumet) 13-636-AB15
pH/ATC electrode Fisher Scientific (Accumet) 13-620-111
PhCR Photochemical Reactor Waters (Vicam) 600001222
Pipette, pasteur Fisher Scientific 13-678-20D 9"
Pipettor (1 mL) (Reference 2) Eppendorf 4924000088
Pipettor (10 μL) (Reference) Eppendorf 022470051D
Pipette tips: 10 μL, 200 μL, 1 mL Eppendorf F144054M
Pipettor (200 µL)(Ergofit)  Fisher Scientific 12-146-679
Plates, petri (100x15mm) Fisher Scientific FB0875713
Potato Dextrose Agar (500g) Becton Dickinson   BD213400
Reinforced bead tube (2 mL) Omni International 19-660
Reinforced bead tube (7 mL) Omni International 19-651
Repipettor, Dispensette III (10mL) Brandtech 4701141
Resveratrol Sigma-Aldrich R5010-100MG
Scoop (custom) Custom made
screwcap jar (250 mL)  Corning (Pyrex) 1395250
Silica gel, spherical (200-400 mesh)  Supelco 97727-U 100 g
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
SPE extract clean 1.5-mL polypropylene column  American Chromotography Supplies SP-5122382
SPE extract clean PP frits (for 1.5 mL minicolumn) American Chromotography Supplies SP-3119414
Spectrophotometer, UV-visible Fisher Scientific 14-385-351 (Genesys 50)
Test tube Corning (Pyrex) 982516X 16x125mm
Test tube (Disposable)(16x125mm) Fisher Scientific 14-961-31
Test tube (Disposable)(150x250mm) Fisher Scientific 14-961-34
Thermo Vanquish DAD detector (UPLC) Thermo Scientific VF-D11-A-01
Thermo Vanquish Fluourescense detector (UPLC) Thermo Scientific VF-D51-A
Thermo Vanquish quaternary pump F (UPLC) Thermo Scientific VF-P20-A
Thermo Vanquish Split Sampler FT (UPLC) Thermo Scientific VF-A10-A-02
Tween 20 (polysorbate 20) (enzyme grade) Fisher Scientific BP337-500
Vial caps (4mL) Fisher Scientific C4015-75A
Vial caps (autosampler) Fisher Scientific C4010-60A
Vials & caps (16 mL) Thermo Scientific B7800-4
Vials, glass (4mL) Fisher Scientific C4015-1
Vials, polypropylene (autosampler) (400mL) Fisher Scientific C4010-11
Water, Optima  Fisher Scientific W6-4

References

  1. Janila, P., et al. Molecular breeding for introgression of fatty acid desaturase mutant alleles (ahFAD2A and ahFAD2B) enhances oil quality in high and low oil containing peanut genotypes. Plant Sci. 242, 203-213 (2016).
  2. Rasooly, R., Hernlem, B., He, X., Friedman, M. Non-linear relationships between aflatoxin B1 levels and the biological response of monkey kidney vero cells. Toxins (Basel). 5 (8), 1447-1461 (2013).
  3. American Association for Cancer Research: AACR. An evaluation of chemicals and industrial processes associated with cancer in humans based on human and animal data: IARC Monographs Volumes 1 to 20. Cancer Res. 40 (1), 1-12 (1980).
  4. Turner, P. C. The molecular epidemiology of chronic aflatoxin driven impaired child growth. Scientifica. , 21 (2013).
  5. Williams, J. H., et al. Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions. Am. J. Clin. Nutr. 80 (5), 1106-1122 (2004).
  6. van Egmond, H. P., Jonker, M. A., Abbas, H. K. Worldwide regulations on aflatoxins. Aflatoxinandfood safety. , 77-93 (2005).
  7. European Commission. Commission Regulation (EC) 1525/98. Off. J. Eur. Comm. L. 201, 43-46 (1998).
  8. Bressano, M., et al. Introgression of peanut smut resistance from landraces to elite peanut cultivars (Arachis hypogaea L). PLoS ONE. 14 (2), e0211920 (2019).
  9. de Blas, F. J., et al. Identification of smut resistance in wild Arachis species and its introgression into peanut elite lines. Crop Sci. 59 (4), 1657-1665 (2019).
  10. Mallikarjuna, N., Pande, S., Jadhav, D. R., Sastri, D. C., Rao, J. N. Introgression of disease resistance genes from Arachis kempff-mercadoi into cultivated groundnut. Plant Breeding. 123 (6), 573-576 (2004).
  11. Moretzsohn, M. C., et al. Genetic diversity of peanut (Arachis hypogaea L.) and its wild relatives based on the analysis of hypervariable regions of the genome. BMC Plant Biol. 4, 1-10 (2004).
  12. Arias, R. S., et al. New tools to screen wild peanut species for aflatoxin accumulation and genetic fingerprinting. BMC Plant Biol. 18 (1), 170 (2018).
  13. Dorner, J. W., Cole, R. J., Sanders, T. H., Blankenship, P. D. Interrelationship of kernel water activity, soil temperature, maturity, and phytoalexin production in preharvest aflatoxin contamination of drought-stressed peanuts. Mycopathologia. 105 (2), 117-128 (1989).
  14. Paxton, J. D., Sharma, R. P., Salunkhe, D. K. Biosynthesis and accumulation of legume phytoalexins. Mycotoxins and phytoalexins. , 485-499 (1991).
  15. Cole, R. J., Dorner, J. W., Sharma, R. P., Salunkhe, D. K. Peanut phytoalexins. Mycotoxins and phytoalexins. , 501-509 (1991).
  16. Subba Rao, P. V., Strange, R. N., Daniel, M., Purkayastha, R. P. Chemistry, biology, and role of groundnut phytoalexins in resistance to fungal attack. Handbook of phytoalexin metabolism and action. , 199-227 (1995).
  17. Sobolev, V. S., Guo, B. Z., Holbrook, C. C., Lynch, R. E. Interrelationship of phytoalexin production and disease resistance in selected peanut genotypes. J. Agric. Food. Chem. 55 (6), 2195-2200 (2007).
  18. Paxton, J. Phytoalexins: a working redefinition. J. Phytopathol. 101, 106-109 (1981).
  19. Mansfield, J. W., Bailey, J. A., Mansfield, J. W. The role of phytoalexins in disease resistance. Phytoalexins. , 153-288 (1982).
  20. Strange, R. N., Ayers, P. G. Resistance: the role of the hypersensitive response and phytoalexins. Plant response to foliar pathogens. , 39-56 (1992).
  21. Sobolev, V. S., et al. Biological activity of peanut (Arachis hypogaea) phytoalexins and selected natural and synthetic stilbenoids. J. Agric. Food Chem. 59 (5), 1673-1682 (2011).
  22. Sobolev, V. S. Localized production of phytoalexins by peanut (Arachis hypogaea) kernels in response to invasion by Aspergillus Species. J. Agric. Food Chem. 56 (6), 1949-1954 (2008).
  23. Sobolev, V. S., Neff, S. A., Gloer, J. B. New stilbenoids from peanut (Arachis hypogaea) seeds challenged by an Aspergillus caelatus strain. J. Agric. Food Chem. 57 (1), 62-68 (2009).
  24. Trucksess, M. W., et al. Immunoaffinity column coupled with solution fluorometry or liquid chromatography postcolumn derivatization for determination of aflatoxins in corn, peanuts, and peanut butter: collaborative study. J. AOAC Int. 74 (1), 81-88 (1991).
  25. Dorner, J. W., Blankenship, P. D., Cole, R. J. Performance of two immunochemical assays in the analysis of peanuts for aflatoxin at 37 field laboratories. J. AOAC Int. 76 (3), 637-643 (1993).
  26. Stroka, J., Anklam, E. Immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography using post-column bromination for determination of aflatoxins in peanut butter, pistachio paste, fig paste, and paprika powder: collaborative study. J. AOAC Int. 83 (2), 320-340 (2000).
  27. Pal, A., Acharya, D., Saha, D., Roy, D., Dhar, T. K. In situ sample cleanup during immunoassay: a simple method for rapid detection of aflatoxin B1 in food samples. J. Food Prot. 68 (10), 2169-2177 (2005).
  28. Sobolev, V. S. Simple, rapid, and inexpensive cleanup method for quantitation of aflatoxins in important agricultural products by HPLC. J. Agric. Food Chem. 55 (6), 2136-2141 (2007).
  29. Sobolev, V. S., Dorner, J. W. Cleanup procedure for determination of aflatoxins in major agricultural commodities by liquid chromatography. J. AOAC Int. 85 (3), 642-645 (2002).
  30. Levi, C. P., Borker, E. Survey of green coffee for potential aflatoxin contamination. J. AOAC. 51 (3), 600-602 (1968).
  31. Levi, C. P. Collaborative study on a method for detection of aflatoxins B1 in green coffee beans. J. AOAC. 52 (6), 1300-1303 (1969).
  32. Scott, P. M. Note on analysis of aflatoxins in green coffee. J. AOAC. 51, 609 (1968).
  33. Bicking, M. K. L., Kniseley, R. N., Svec, H. J. Coupled-column system for quantitating low levels of aflatoxins. J. AOAC. 66 (4), 905-908 (1983).
  34. Kamimura, H., et al. Simple, rapid cleanup method for analysis of aflatoxins and comparison with various methods. J. AOAC. 68 (3), 458-461 (1985).
  35. Hoogenboom, L. A., et al. Genotoxicity testing of extracts from aflatoxin-contaminated peanut meal, following chemical decontamination. Food Addit. Contam. 18 (4), 329-341 (2001).
  36. Castro, L., Vargas, E. A. Determining aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in maize using Florisil clean up with thin layer chromatography and visual and densitometric Quantitation. Cienc. Tecnol. Ailment. Campinas. 21, 115-122 (2001).
  37. Arias, R. S., Dang, P. M., Sobolev, V. S. RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem. J. Vis. Exp. (106), e53398 (2015).
  38. Whitaker, T. B., Dorner, J. W., Giesbrecht, F. G., Slate, A. B. Variability among aflatoxin test results on runner peanuts harvested from small field plots. Peanut Sci. 31 (1), 59-63 (2004).

Play Video

Cite This Article
Sobolev, V. S., Arias, R. S., Massa, A. N., Walk, T. E., Orner, V. A., Lamb, M. C. Non-destructive SPE-UPLC-based Quantification of Aflatoxins and Stilbenoid Phytoalexins in Single Peanut (Arachis spp.) Seeds. J. Vis. Exp. (206), e66574, doi:10.3791/66574 (2024).

View Video