实时评估隔离、加压淋巴管中的绝对、胞质、游离 Ca²⁺ 和相应的收缩力

9至13周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠是从商业供应商处购买的。到达后，所有大鼠都以标准实验室饮食在阿肯色大学医学部（UAMS）实验室动物医学（DLAM）设施中饲养和维护，并暴露于25 °C的12小时光照：黑暗循环中。所有程序均按照UAMS机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的动物使用协议#4127执行。 1.肠系膜左心室的解剖和插管 注意：在分离肠系膜左心室之前设置灌注室非常重要，以确保没有会干扰实验的流动或泄漏中断。 灌注浴制备从商业供应商处购买硼硅酸盐玻璃微量移液器（外径 1.2 mm，内径 0.68 mm，拉至外尖端直径 75-100 μm）。将微量移液器（又名套管）切割并抛光至约 1-2 cm 长，以便安装到隔离的血管灌注室中。 将容器灌注室中每个安装的玻璃套管连接到独立的压力传感器，该压力传感器与使用聚乙烯管的独立重力进料压力调节器对齐。注意：这允许根据研究设计独立操纵流入和流出压力。 图 1 详细介绍了此设置。 回填灌注室（5mL），玻璃微量移液器和独立的重力进料压力调节器以及带有生理盐溶液（PSS;119mM NaCl;24mM NaHCO3;1.17mM NaH2PO4;4.7mM KCl;1.17mM MgSO4;5.5mM C6H12O6 （葡萄糖）;0.026 mM C10H16N2O8 （EDTA）;和1.6 mM CaCl2） 没有任何气泡。然后，夹紧压力，使插管不受压力。注意：该溶液的 pH 值为 ~7.5。如步骤1.3.7所述，在灌注浴中利用CO2 鼓泡作用于PSS内的碳酸氢盐缓冲系统，使pH值保持在7.4。EDTA在这里用于螯合过量的Ca2+ 离子。 打结的准备在显微镜下使用编织丝线（8-0 号）打两个反手结。关键步骤如图 2 所示。分离单根细丝。 使用两个带有微钝尖端的 Dumont #5 镊子，并使用一个镊子在另一个镊子的尖端周围形成双环。 使用环形镊子，抓住缝合线的松散端并将其拉过两个环，确保不要将结完全拉合并留下一个小开口。 使用 Vanna 弹簧剪刀从两侧剪下多余的缝合线。稍后使用这些结将 LV 固定在套管上。注意：请勿使用您将用于解剖或插管的相同镊子，因为在打结过程中更有可能损坏镊子尖端。 肠系膜左心室的分离和插管通过给予1.5L / min O2 过量的5%异氟醚对动物进行深度麻醉，并通过斩首放血。 首先沿腹壁中线纵向切开整个肠系膜以解剖肠系膜左心室，将肠系膜外切开，然后剪断幽门括约肌下方和盲肠上方~2-3cm的连接以及与直肠的连接，从而分离出肠系膜左心室。 在 200 mL 冰冷的 PSS 中洗涤解剖的整个肠系膜，然后转移到含有冰冷 PSS 的硅胶衬里 （8-10 mm） 培养皿 （100 mm） 中并固定在其中。 使用立体显微镜从周围脂肪和结缔组织中解剖二级肠系膜左心室，解剖 Dumont #5 Inox 细镊子和 Vanna 弹簧剪刀。为了帮助识别从组织中取出左心室的末端，请在左心室的近端留下一小块脂肪。 将解剖的左心室转移到血管灌注室，以便在玻璃套管上插管。 使用两个预磨尖的 Dumont #5 Inox 细镊子，直尖端 （0.05 x 0.01 mm） 插管左心室，左心室的远端位于 P1 套管（流入）上，血管近端位于 P2 套管（流出）上，以模拟淋巴流动的方向。注意： P1 和 P2 套管是相同的，只是 LV 的连接端不同。重要的是，使用在尖端完全配合且不会损坏的镊子，以便于抓住薄血管壁。将一个预打结滑到每个玻璃套管上，然后将容器固定在套管上。 使用一小块脂肪来帮助定向左心室方向，首先将远端套管到 P1 上。 将结滑下套管并拧紧以固定 LV。 确保不要过度拧紧并折断套管尖端。 在灌注室中将左心室加压至 4-5 mm Hg。注意：出于我们的目的，我们将 P1 和 P2 压力设置为相等;然而，根据实验条件，可以调整每个套管处的压力以引起剪切应力或回流。 重复步骤 1.3.6.1-1.3.6.4 将左心室的近端插管到 P2 上。 将装有 7% 二氧化碳 （CO2）/93% 氧气 （O2） 的冒泡石放入浴室中，以保持生理 pH 值。 将腔室连接到温度调节器，并将其设置为 37 °C，以使 LV 平衡并产生稳定的自发收缩（约 30 分钟）。注意： 图 1 详细显示了此设置。 2. 左心室中 [Ca2+]i 绝对浓度的测量 空管左心室的 Fura-2AM 染色在自发收缩发生后（从步骤1.3.8开始），将LVs与Fura-2-乙酰氧基甲酯（Fura-2AM;2μM或10μL/ 5mL）和pluronic acid（PA;0.02%W / V或5μL / 5mL 20%PA）在黑暗中孵育30分钟。注意：添加 Fura-2AM 后，所有剩余步骤必须在黑暗中执行。 30分钟后，通过用负压真空排空整个浴体积，用温度匹配（37 °C）无试剂PSS替换灌注室中的溶液3x。注意： 这应该快速完成，以尽量减少 LV 悬浮在空气中的时间。例如，使用双手，右手用于真空吸尘，左手用于更换新的无试剂 PSS。 洗涤后，将 LVs 在黑暗中孵育 15 分钟，以去除多余的指示剂并允许去酯化。 捕获钙2+ 荧光和血管直径将腔室转移到配备有 LED 光源、20x S Fluor 物镜、细胞取景适配器和快速 CMOS 摄像机系统的倒置荧光显微镜载物台上，该系统可实现 15 Hz 的逐帧荧光捕获。注意： 图 3 显示了此工作流设置的示意图。可以使用至少 15 fps 的 CCD 相机捕获 Ca2+ 信号。 将显微镜连接到配备成像软件的计算机，以记录荧光和边缘检测。注意： 引用的软件还可以同时记录压力;但是，此处不包括这一点。 打开 LED 光源和荧光系统接口。注意：此处描述的软件说明适用于引用的软件，但可以使用其他软件来获取此数据。 打开软件 （IonWizard）。 在 “文件 ”选项卡下，选择“ 新建”。 在 “收集 ”选项卡下，选择 “实验”。 加载所需的实验模板，然后单击 “确定”。注意：您需要设置一个包含要测量的参数的实验模板。有关模板设置的说明，请参阅软件手册29。 调整屏幕上的迹线，按降序查看 血管直径、分子 （340 信号）、 分母 （380 信号）和 比率 。 根据需要调整 y 轴刻度，以帮助可视化迹线。在 “跟踪”下，选择 “编辑用户限制”。确保未选中“自动限制”。 选择要调整的参数，输入轴的最小值和最大值，然后选择“ 确定”。 要开始实验，请单击“ 开始 ”（位于屏幕底部）。 要同时测量左心室直径，请使用成像系统中附带的边缘检测软件，该软件可在 3 Hz 下生成左心室的收缩迹线。 使用这些测量值来分析第 3 节中描述的收缩和节律性参数，如图 4 所示。请务必调整照明，使 LV 墙显示为暗线。 选择一个没有脂肪和碎屑的感兴趣区域 （ROI）。实验开始后，请勿移动此 ROI。 确保设置阈值，以便在整个收缩周期中都能检测到血管壁边缘。 对于荧光测量，请打开光电倍增管 （PMT）。 通过使用 LED 照明器在 50 ms 曝光中交替使用 340 和 380 nm 波长来激发 Fura-2，并在整个成像场中以 15 Hz 捕获 510 nm 的发射光谱。注意：对于整个系列实验，保持所有光学参数（激发设置、发射滤光片、物镜和二向色镜）相同非常重要，以获得可重复的 Ca2+ 测量值。 通过首先获得 340 和 380 荧光来测量信噪比，LV 位于视野（信号）的中间，然后使用载物台操纵器将视野移动到没有容器的浴槽边缘（注意避开硅胶衬里边缘和/或从浴液中去除任何碎屑）以捕获背景。注意：每次进行 Ca2+ 测量时，务必导航回容器的原始部分。 用温度匹配的无试剂 PSS 交换浴液，以去除浴液中多余的指示剂。可能需要几次浴交换才能去除多余的 Fura-2，因此请重复此交换，直到信号与背景比约为 10：1。 记录基线 Fura-2 荧光信号和自发收缩约 30 分钟，然后是硝苯地平 （NIF; 0.1-100 nM） 的累积浓度反应，硝苯地平是一种电压依赖性 Cav1.x 拮抗剂。获得每种药物浓度的背景测量值。 在每个实验结束时，用温度匹配的 Ca2+ 无 PSS 洗涤 LV，以获得在没有 Ca2+ 的情况下的最小 Fura-2 荧光信号 （Rmin） 和 LV 的最大直径。一定要测量背景。注：不含 Ca2+ 的 PSS 与 PSS 具有相同的成分，但不含 CaCl2，EDTA 被 1 mM EGTA （C14H24N2O10） （pH ~7.5） 取代。 将浴溶液与含有 10 mM Ca2+ 和离子霉素 （10 μM IONO）（一种 Ca2+ 离子载体）的温度匹配的 PSS 交换，以获得在饱和 Ca2+ 条件下的最大 Fura-2 荧光信号 （Rmax） 和 LV 的最小直径。一定要测量背景。 测量绝对值的公式 [Ca2+]i使用 Rmin 和 Rmax 校准 340 和 380 nm 波长的比率，并计算绝对胞质游离 Ca2+ 浓度 （[Ca2+]i）。 使用公式 （1）26 计算绝对胞质游离 Ca2+ 浓度 （[Ca2+]i）：（一）其中 Kd = 225 nM（Fura-2 的解离常数）26，R = 340/380 比率，在没有 Ca2+ 的情况下，Rmin = 340/380 比率，在饱和 Ca2+ 条件下，Rmax = 340/380 比率，在没有 Ca2+ 的情况下，S 自由 = 380 信号，在饱和 Ca2+ 条件下，S结合 = 380 信号注：所有荧光信号均已针对背景荧光进行了校正。 图 5 是一个 Ca2+ 迹线示例，详细说明了要记录的参数。将基线 Ca2+ 定义为 Ca2+ 峰值之前的最低静息 Ca2+，将峰值 Ca2+ 定义为 Ca2+ 峰值期间达到的最高 Ca2+。振幅是峰值和基线 Ca2+ 之间的差值。直接从成像软件导出所有参数，但 Ca2+ 尖峰的频率除外，该频率将离线计算为 Ca2+ 尖峰/秒的数量。以下是参考软件中获取这些参数的关键步骤。注意：整个轨迹可以导出为.txt文件，所有参数都可以在您选择的软件中进行分析或计算。 对于 Rmin，突出显示在无 Ca2+ 的 PSS 期间与背景对应的分子迹线部分。将打开一个对话框，并提供此部分跟踪的值。 在 “操作”下，选择 “常量”。 选择 Calcium-Numeric 背景， 然后输入上一步中分子和分母的背景数字。单击“ 确定”。 突出显示 Ratio 迹线中对应于 Ca2+ 无 Psa 期间最低比率的部分。这是 R最小值。另请注意此部分的分母值;这是 S免费。 重复步骤 2.3.4 到 2.3.7，将 Rmax 和 S 与对应于高 Ca、2+ 游离 PSS 和最高比率的迹线部分绑定。 在 “操作”下，选择 “常量”。 选择 Calcium-Calcium Calibration 并输入 公式 1 中列出的值。单击“ 确定”。 按照步骤 2.2.8 中所述调整屏幕上的一条迹线，以便您可以看到 Calcium-Numeric 减去的 Calcium。 执行单调瞬态分析以获取其余参数。有关此操作的说明，请参阅软件手册30。 或者，在 “导出”下，选择 “当前跟踪”。 选择要将 .txt 文件导出到的位置，然后单击“ 确定”。注意：请确保单击要导出的单个跟踪。您可以导出整个跟踪或跟踪的选定部分。 3. 左心室收缩力和节律性的测量 如上所述，集成在成像系统中的边缘检测软件可生成用于 LV 直径测量的收缩迹线。使用这些测量值来分析收缩和节律性参数。 图 4 是一个收缩跟踪示例，详细说明了要记录哪些收缩参数。在 Diameter trace30 上使用单调瞬态分析功能直接从成像软件导出所有参数，但收缩频率、计算的流量和间隔除外，这些参数将离线计算。注意：整个迹线可以导出到.txt文件中，所有参数都可以在您选择的软件中使用以下公式进行分析或计算。 EDD、ESD、幅度、频率和计算出的流量测量值测量左心室在节律性和自主收缩期间可以达到的最大和最小直径（分别为舒张末期直径 [EDD] 和收缩末期直径 [ESD]。 计算收缩幅度 （AMP） 作为 EDD 和 ESD 之间的差值。 将频率计算为每个测量周期的收缩次数（以秒为单位）。 使用公式 （2） 计算出的每 μm 流量：计算流量 = π/4（EDD2- ESD2）F （2）其中 EDD2 = 松弛状态下的血管横截面积，ESD2 = 收缩期间血管横截面积的测量值，F = 收缩频率/秒 节奏性： 收缩和放松时间：左心室节律性的其他指标是收缩时间和放松时间。 将收缩时间定义为 LV 每次收缩达到 ESD 所需的时间。 将松弛时间定义为左心室每次松弛达到 EDD 所花费的时间，这将给出在特定时间范围内与绝对 [Ca2+]i 相关的节律性的总体指示。 根据公式 （3） 计算间隔时间 （ΔT）。Δt = t2 （ESD2）-t1 （ESD1） （3）