Здесь представлен протокол культивирования органоидов пищевода человека и культуры границы раздела воздух-жидкость. Культура воздушно-жидкостного интерфейса органоидов пищевода может быть использована для изучения влияния цитокинов на эпителиальный барьер пищевода.
Плоский эпителий пищевода подвергается непосредственному воздействию окружающей среды, постоянно сталкиваясь с чужеродными антигенами, включая пищевые антигены и микробы. Поддержание целостности эпителиального барьера имеет решающее значение для предотвращения инфекций и предотвращения воспаления, вызванного безвредными антигенами пищевого происхождения. В данной статье представлены упрощенные протоколы получения органоидов пищевода человека и культур воздушно-жидкостных границ раздела из биопсии пациента для изучения эпителиального компартмента пищевода в контексте тканевого гомеостаза и заболевания. Эти протоколы стали важными научными вехами за последнее десятилетие, описывая трехмерные органоподобные структуры из первичных клеток, полученных от пациента, органоидов и культур воздушно-жидкостных границ раздела. Они дают возможность исследовать функцию специфических цитокинов, факторов роста и сигнальных путей в эпителии пищевода в трехмерной структуре, сохраняя при этом фенотипические и генетические свойства донора. Органоиды предоставляют информацию о микроархитектуре тканей путем оценки транскриптома и протеома после цитокиновой стимуляции. В отличие от этого, культуры на границе раздела воздух-жидкость позволяют оценить целостность эпителиального барьера с помощью трансэпителиального сопротивления (TEER) или измерения потока макромолекул. Объединение этих органоидов и культур воздушно-жидкостных границ раздела является мощным инструментом для продвижения исследований в условиях нарушенного эпителиального барьера пищевода.
Воспаление пищевода нарушает целостность эпителиального барьера 1,2,3,4,5, что наблюдается при эозинофильном эзофагите (ЭоЭ), хроническом воспалительном заболевании пищевода с преобладанием Th26. EoE был впервые описан в 1990-х годах как 7,8 и индуцируется преимущественно пищевыми антигенами 9,10,11,12,13. Наиболее часто встречающимися симптомами ЭоЭ у взрослого населения являются дисфагия и пищевая имперация14. У детей ЭоЭ обычно проявляется отставанием в росте, отказом от пищи, рвотой и болью в животе15. Полногеномные ассоциативные исследования (GWAS) выявили гены риска EoE, участвующие в целостности эпителиального барьера, переместив эпителий в центр исследований EoE 16,17,18. Транскриптомика EoE также показала, что нарушение процесса дифференцировки и гиперплазия реактивной базальной зоны вызывают нарушение барьерной функции эпителия пищевода 3,5,19,20,21,22. Раннее понимание того, что ЭоЭ является Th2-опосредованнымзаболеванием6, привело к открытию IL-13 в качестве движущего медиатора, нарушающего целостность эпителия 3,4,21,23. Экспериментальные системы, позволяющие препарировать цитокин-опосредованные эффекты на целостность эпителия от нарушения внутреннего барьера через генетическую предрасположенность, дают возможность изучить сложное взаимодействие между иммунными клетками и эпителием в ЭоЭ. Пищеводные органоиды человека и культуры воздушно-жидкостного интерфейса (ОПЛ) были предложены в качестве ценных инструментов для анализа влияния цитокиновой стимуляции на целостность эпителия5.
Первый протокол для получения взрослых тканеспецифических стволовых клеток (ASC) пищеводных органоидов был разработан через пять лет после первых опубликованных сообщений о кишечных органоидах в 2009 году с использованием кишечных Lgr5+ ASC, повторяющих эпителиальный компартмент тонкой кишки24. ДеВард и др. первыми получили органоиды из эпителиальных клеток пищевода мышей25. В 2018 году Kasagi et al. получили органоиды пищевода человека из иммортализованной клеточной линии плоского эпителия пищевода человека EPC2-hTERT и первичных клеток, полученных от пациента26. В том же году Zhang et al. успешно получили индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), полученные из органоидов пищевода. Они определили значение ингибирования TGFβ и костного морфогенетического белка (BMP) для развития клеток-предшественников пищевода (EPC) и решающую роль передачи сигналов Notch в дифференцировке стратифицированного плоского эпителия26,27. Трисно и его коллеги дополнили эти результаты, определив Sox2 в качестве ингибитора Wnt, который направляет судьбу развития в сторону дифференцировки пищевода. Последующее усовершенствование протоколов, состава среды и условий культивирования увеличило скорость образования органоидов и сделало возможным субкультивирование и восстановление органоидов после криоконсервации 26,29,30,31,32. Несмотря на то, что эти органоиды являются мощными инструментами для изучения архитектуры тканей и экспрессии потенциальных генов-мишеней после стимуляции цитокинами, органоиды пищевода не дают возможности измерить трансэпителиальную резистентность (TEER) или поток макромолекул в качестве прямых измерений целостности барьера. Как ранее было описано Шерриллом и коллегами22, культуры ALI, моделирующие дифференцировкуэпителия4, позволяют напрямую оценить целостность эпителия. Объединение органоидов, полученных от пациента, и культур ALI является мощным инструментом для исследования архитектуры тканей и целостности эпителиального барьера в EoE.
Ниже приведены процедуры с инструкциями по выделению жизнеспособных клеток из биопсии пищевода и созданию органоидов пищевода и культур ОПЛ, которые в дальнейшем могут быть использованы для изучения влияния цитокинов на целостность барьера.
Проводимые процедуры позволяют культивировать органоиды и культуры ОЛ пациентского происхождения с высокими перспективами успеха. Протокол на основе органоидов был взят из первого опубликованного протокола, в котором сообщалось о создании органоидов пищеводачеловека26…
The authors have nothing to disclose.
Грант SNSF 310030_219210 для J.H.N. поддержал публикацию этой рукописи без ограничений. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.
1250 µL Griptip – Filter | Integra | 4445 | |
300 µL Griptip – Filter | Integra | 4435 | |
70 µM cell strainer | Sarstedt | 83.3945.070 | |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich (Merck) | A4544 | |
Bovine pituitary extract | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | |
Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures | Greiner Bio-One | 7.657 185 | |
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear | R&D Systems (Bio-Techne) | 3532-010-02 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade | Carl Roth | A994 | |
Dispase I | Corning | 354235 | |
Dispase II | Sigma-Aldrich (Merck) | D4693 | |
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich (Merck) | D8537 | |
EVE Automated Cell Counter | NanoEntek | EVE-MC | |
EVE Cell counting slide | NanoEntek | EVS-050 | |
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran | Sigma-Aldrich (Merck) | FD4 | average mol wt 3000-5000 |
Heraeus – Megafuge 40R | Thermo Fisher Scientific | 75004518 | |
Human recombinant epidermal growth factor | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
Keratinocyte-SFM | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 17005042 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 15140122 | |
Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein | R&D Systems (Bio-Techne) | 251-KG-010/CF | |
Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
Single Channel EVOLVE 100-1000 µL | Integra | 3018 | |
Single Channel EVOLVE 20-200 µL | Integra | 3016 | |
Syringe 1 mL | 1134950 | ||
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich (Merck) | T9128 | |
Trypsin-EDTA | SAFC Biosciences (Merck) | 59418C | |
Y27632 dihydrochloride | Tocris (Bio-Techne) | 1254 |