نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد للتحقيق في الحاجز الظهاري في التهاب المريء اليوزيني
Summary
هنا ، يتم توفير بروتوكول لثقافة عضويات المريء البشري وثقافة واجهة الهواء السائل. يمكن استخدام ثقافة واجهة الهواء السائل لعضويات المريء لدراسة تأثير السيتوكينات على الحاجز الظهاري المريئي.
Abstract
تتعرض ظهارة المريء الحرشفية مباشرة للبيئة ، وتواجه باستمرار المستضدات الأجنبية ، بما في ذلك مستضدات الطعام والميكروبات. يعد الحفاظ على سلامة الحاجز الظهاري أمرا بالغ الأهمية للوقاية من العدوى وتجنب الالتهاب الناجم عن المستضدات المشتقة من الغذاء غير الضارة. توفر هذه المقالة بروتوكولات مبسطة لتوليد عضويات المريء البشرية وثقافات واجهة الهواء السائل من خزعات المريض لدراسة المقصورة الظهارية للمريء في سياق توازن الأنسجة والمرض. كانت هذه البروتوكولات معالم علمية مهمة في العقد الماضي ، حيث وصفت الهياكل الشبيهة بالأعضاء ثلاثية الأبعاد من الخلايا الأولية المشتقة من المريض ، والمواد العضوية ، وثقافات واجهة الهواء والسائل. إنها توفر إمكانية التحقيق في وظيفة السيتوكينات المحددة وعوامل النمو ومسارات الإشارات في ظهارة المريء في إطار ثلاثي الأبعاد مع الحفاظ على الخصائص الظاهرية والجينية للمتبرع. توفر المواد العضوية معلومات عن العمارة المجهرية للأنسجة من خلال تقييم النسخ والبروتين بعد تحفيز السيتوكين. في المقابل ، تسمح ثقافات واجهة الهواء السائل بتقييم سلامة الحاجز الظهاري من خلال المقاومة عبر الظهارة (TEER) أو قياسات تدفق الجزيئات. يعد الجمع بين هذه الكائنات العضوية وثقافات واجهة الهواء السائل أداة قوية لتطوير البحث في ظروف الحاجز الظهاري المريئي الضعيف.
Introduction
يضر التهاب المريء بسلامة الحاجز الظهاري1،2،3،4،5 ، كما لوحظ في التهاب المريء اليوزيني (EoE) ، وهو مرض التهابي مزمن يهيمن عليه Th2 في المريء6. تم وصف EoE لأول مرة في تسعينيات القرن العشرين7،8 ويتم تحريضه في الغالب بواسطة مستضدات الغذاء9،10،11،12،13. الأعراض الأكثر شيوعا ل EoE في السكان البالغين هي عسر البلع وانحشار الطعام14. في الأطفال ، يظهر EoE عادة مع الفشل في النمو ، ورفض الطعام ، والقيء ، وآلام البطن15. حددت دراسات الارتباط على مستوى الجينوم (GWAS) جينات خطر EoE المشاركة في سلامة الحاجز الظهاري ، مما أدى إلى نقل الظهارة إلى بؤرة أبحاث EoE16،17،18. كشفت EoE transcriptomics كذلك أن عملية التمايز الضعيفة وتضخم المنطقة القاعدية التفاعلية يتسببان في وظيفة الحاجز للخطر لظهارة المريء3،5،19،20،21،22. أدى الفهم المبكر لكون EoE مرضا بوساطة Th26 إلى اكتشاف IL-13 كوسيط قيادة عن طريق الإخلال بسلامة الظهارة3،4،21،23. توفر الأنظمة التجريبية التي تسمح بتشريح التأثيرات بوساطة السيتوكين على السلامة الظهارية من ضعف الحاجز الداخلي من خلال الاستعداد الوراثي إمكانية دراسة التفاعل المعقد بين الخلايا المناعية والظهارة في EoE. تم اقتراح عضويات المريء البشرية ومزارع واجهة الهواء السائل (ALI) كأدوات قيمة لتحليل عواقب تحفيز السيتوكين على سلامة الظهارة5.
تم إنشاء البروتوكول الأول لتوليد عضويات المريء المشتقة من الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة البالغة (ASC) بعد خمس سنوات من التقارير المنشورة الأولى عن العضويات المعوية في عام 2009 باستخدام Lgr5 + ASCs المعوية التي تلخص المقصورة الظهارية للأمعاءالدقيقة 24. كان DeWard et al. رائدا في توليد المواد العضوية من الخلايا الظهارية المريئيةللفئران 25. في عام 2018 ، قام Kasagi et al. بتوليد عضويات المريء البشري من خط خلايا ظهارة المريء الحرشفية البشرية الخالدة EPC2-hTERT والخلايا الأولية المشتقة من المريض26. في نفس العام ، نجح Zhang et al. في توليد عضويات المريء المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC). لقد حددوا أهمية تثبيط TGFβ والبروتين المورفولوجي العظمي (BMP) لتطوير الخلايا السلفية المريئية (EPC) والدور الحاسم لإشارات Notch في تمايز الظهارة الحرشفية الطبقية26,27. استكمل تريسنو وزملاؤه هذه النتائج من خلال تحديد Sox2 كمثبط Wnt يوجه مصير النمو نحو تمايز المريء28. أدت التحسينات اللاحقة للبروتوكولات والتركيب المتوسط وظروف الاستزراع إلى زيادة معدل تكوين الأعضاء وجعلت الاستزراع الفرعي واستعادة المواد العضوية بعد الحفظ بالتبريد ممكنا26،29،30،31،32. على الرغم من أن هذه الكائنات العضوية هي أدوات قوية لدراسة بنية الأنسجة والتعبير عن الجينات المستهدفة المحتملة بعد التحفيز بالسيتوكينات ، إلا أن عضويات المريء لن توفر إمكانية قياس المقاومة عبر الظهارة (TEER) أو تدفق الجزيئات الكبيرة كمقاييس مباشرة لسلامة الحاجز. كما وصفه شيريل وزملاؤهسابقا 22 ، تسمح ثقافات ALI التي تنمذجة التمايز الظهاري4 بإجراء تقييمات مباشرة للسلامة الظهارية. يعد الجمع بين المواد العضوية المشتقة من المريض ومزارع ALI أداة قوية للتحقيق في بنية الأنسجة وسلامة الحاجز الظهاري في EoE.
فيما يلي إجراءات مع تعليمات لعزل الخلايا القابلة للحياة من خزعات المريء وإنشاء مزارع عضوية المريء و ALI التي يمكن استخدامها بشكل أكبر لدراسة آثار السيتوكينات على سلامة الحاجز.
Protocol
Representative Results
Discussion
تسمح الإجراءات المقدمة بزراعة المواد العضوية المشتقة من المريض وثقافات ALI مع احتمالات عالية للنجاح. تم تكييف بروتوكول العضوي من أول بروتوكول منشور يبلغ عن توليد عضويات المريء البشري26 ومن بروتوكول32 المنشور مؤخرا. وصف شيريل وزملاؤه نموذج ALI22. تساعد ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
دعمت منحة SNSF 310030_219210 إلى J.H.N. نشر هذه المخطوطة دون قيود. تم إنشاء الشكل 1 بمساعدة BioRender.com.
Materials
| 1250 µL Griptip – Filter | Integra | 4445 | |
| 300 µL Griptip – Filter | Integra | 4435 | |
| 70 µM cell strainer | Sarstedt | 83.3945.070 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich (Merck) | A4544 | |
| Bovine pituitary extract | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | |
| Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures | Greiner Bio-One | 7.657 185 | |
| Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear | R&D Systems (Bio-Techne) | 3532-010-02 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade | Carl Roth | A994 | |
| Dispase I | Corning | 354235 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich (Merck) | D4693 | |
| Dulbeccos Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich (Merck) | D8537 | |
| EVE Automated Cell Counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| EVE Cell counting slide | NanoEntek | EVS-050 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran | Sigma-Aldrich (Merck) | FD4 | average mol wt 3000-5000 |
| Heraeus – Megafuge 40R | Thermo Fisher Scientific | 75004518 | |
| Human recombinant epidermal growth factor | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Keratinocyte-SFM | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 17005042 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 15140122 | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein | R&D Systems (Bio-Techne) | 251-KG-010/CF | |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Single Channel EVOLVE 100-1000 µL | Integra | 3018 | |
| Single Channel EVOLVE 20-200 µL | Integra | 3016 | |
| Syringe 1 mL | 1134950 | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich (Merck) | T9128 | |
| Trypsin-EDTA | SAFC Biosciences (Merck) | 59418C | |
| Y27632 dihydrochloride | Tocris (Bio-Techne) | 1254 |
References
- Wu, L., et al. Filaggrin and tight junction proteins are crucial for IL-13-mediated esophageal barrier dysfunction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 315 (3), G341-G350 (2018).
- Davis, B. P., et al. Eosinophilic esophagitis-linked calpain 14 is an IL-13-induced protease that mediates esophageal epithelial barrier impairment. JCI Insight. 1 (4), e86355 (2016).
- Blanchard, C., et al. Coordinate interaction between IL-13 and epithelial differentiation cluster genes in eosinophilic esophagitis. J Immunol. 184 (7), 4033-4041 (2010).
- Kc, K., Rothenberg, M. E., Sherrill, J. D. In vitro model for studying esophageal epithelial differentiation and allergic inflammatory responses identifies keratin involvement in eosinophilic esophagitis. PLoS One. 10 (6), e0127755 (2015).
- Kaymak, T., et al. IL-20 subfamily cytokines impair the oesophageal epithelial barrier by diminishing filaggrin in eosinophilic oesophagitis. Gut. 72 (5), 821-833 (2023).
- Straumann, A., Bauer, M., Fischer, B., Blaser, K., Simon, H. U. Idiopathic eosinophilic esophagitis is associated with a T(H)2-type allergic inflammatory response. J Allergy Clin Immunol. 108 (6), 954-961 (2001).
- Straumann, A., Spichtin, H. P., Bernoulli, R., Loosli, J., Vogtlin, J. Idiopathic eosinophilic esophagitis: a frequently overlooked disease with typical clinical aspects and discrete endoscopic findings. Schweiz Med Wochenschr. 124 (33), 1419-1429 (1994).
- Attwood, S. E., Smyrk, T. C., Demeester, T. R., Jones, J. B. Esophageal eosinophilia with dysphagia. A distinct clinicopathologic syndrome. Dig Dis Sci. 38 (1), 109-116 (1993).
- Kelly, K. J., et al. Eosinophilic esophagitis attributed to gastroesophageal reflux: improvement with an amino acid-based formula. Gastroenterology. 109 (5), 1503-1512 (1995).
- Fogg, M. I., Ruchelli, E., Spergel, J. M. Pollen and eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 112 (4), 796-797 (2003).
- Wolf, W. A., Jerath, M. R., Dellon, E. S. De-novo onset of eosinophilic esophagitis after large volume allergen exposures. J Gastrointestin Liver Dis. 22 (2), 205-208 (2013).
- Moawad, F. J., et al. Correlation between eosinophilic oesophagitis and aeroallergens. Aliment Pharmacol Ther. 31 (4), 509-515 (2010).
- Woo, W., Aceves, S. S. The role of the allergist in the management of eosinophilic esophagitis. Curr Opin Gastroenterol. 37 (4), 390-396 (2021).
- Dellon, E. S., et al. Updated International Consensus diagnostic criteria for eosinophilic esophagitis: Proceedings of the AGREE conference. Gastroenterology. 155 (4), 1022-1033 (2018).
- Liacouras, C. A., Spergel, J., Gober, L. M. Eosinophilic esophagitis: Clinical presentation in children. Gastroenterol Clin North Am. 43 (2), 219-229 (2014).
- Sleiman, P. M., et al. GWAS identifies four novel eosinophilic esophagitis loci. Nat Commun. 5, 5593 (2014).
- Kottyan, L. C., et al. Genome-wide association analysis of eosinophilic esophagitis provides insight into the tissue specificity of this allergic disease. Nat Genet. 46 (8), 895-900 (2014).
- Kottyan, L. C., et al. Replication and meta-analyses nominate numerous eosinophilic esophagitis risk genes. J Allergy Clin Immunol. 147 (1), 255-266 (2021).
- Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes Immun. 15 (6), 361-369 (2014).
- Collins, M. H., et al. Newly developed and validated eosinophilic esophagitis histology scoring system and evidence that it outperforms peak eosinophil count for disease diagnosis and monitoring. Dis Esophagus. 30 (3), 1-8 (2017).
- Rochman, M., et al. Profound loss of esophageal tissue differentiation in patients with eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 140 (3), 738-749 (2017).
- Sherrill, J. D., et al. Desmoglein-1 regulates esophageal epithelial barrier function and immune responses in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunol. 7 (3), 718-729 (2014).
- Blanchard, C., et al. IL-13 involvement in eosinophilic esophagitis: transcriptome analysis and reversibility with glucocorticoids. J Allergy Clin Immunol. 120 (6), 1292-1300 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Rep. 9 (2), 701-711 (2014).
- Kasagi, Y., et al. The esophageal organoid system reveals functional interplay between Notch and cytokines in reactive epithelial changes. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (3), 333-352 (2018).
- Zhang, Y., et al. 3D modeling of esophageal development using human PSC-derived basal progenitors reveals a critical role for notch signaling. Cell Stem Cell. 23 (4), 516-529 (2018).
- Trisno, S. L., et al. Esophageal organoids from human pluripotent stem cells delineate sox2 functions during esophageal specification. Cell Stem Cell. 23 (4), 501-515 (2018).
- Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 53 (1), e109 (2020).
- Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
- Nakagawa, H., et al. Modeling epithelial homeostasis and reactive epithelial changes in human and murine three-dimensional esophageal organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 52 (1), e106 (2020).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81, 33-40 (1983).
- Bertolero, F., Kaighn, M. E., Gonda, M. A., Saffiotti, U. Mouse epidermal keratinocytes. Clonal proliferation and response to hormones and growth factors in serum-free medium. Exp Cell Res. 155 (1), 64-80 (1984).
- Bertolero, F., Kaighn, M. E., Camalier, R. F., Saffiotti, U. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (7), 423-428 (1986).
- Witkowski, T. A., et al. Y-27632 acts beyond ROCK inhibition to maintain epidermal stem-like cells in culture. J Cell Sci. 136 (17), (2023).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Sasaki, M., et al. Lysyl oxidase regulates epithelial differentiation and barrier integrity in eosinophilic esophagitis. bioRxiv. , (2023).
- Doyle, A. D., et al. Detergent exposure induces epithelial barrier dysfunction and eosinophilic inflammation in the esophagus. Allergy. 78 (1), 192-201 (2023).
- Hara, T., et al. CD73(+) epithelial progenitor cells that contribute to homeostasis and renewal are depleted in eosinophilic esophagitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1449-1467 (2022).
- Kasagi, Y., et al. Fibrostenotic eosinophilic esophagitis might reflect epithelial lysyl oxidase induction by fibroblast-derived TNF-alpha. J Allergy Clin Immunol. 144 (1), 171-182 (2019).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nat Biotechnol. 37 (3), 303-313 (2019).
- Sorrentino, G., et al. Mechano-modulatory synthetic niches for liver organoid derivation. Nat Commun. 11 (1), 3416 (2020).
- Azouz, N. P., et al. The antiprotease SPINK7 serves as an inhibitory checkpoint for esophageal epithelial inflammatory responses. Sci Transl Med. 10 (444), 9736 (2018).
- Azouz, N. P., et al. Functional role of kallikrein 5 and proteinase-activated receptor 2 in eosinophilic esophagitis. Sci Transl Med. 12 (545), 7773 (2020).
