本プロトコルは、高い再現性と効率で網膜オルガノイドの接着と融合を減少させる最適化された3D神経網膜誘導システムについて説明しています。
網膜症は、世界中で失明の主な原因の1つです。網膜症の早期診断とタイムリーな治療には、その病因を調査することが不可欠です。残念ながら、倫理的な障壁が人間からの証拠の収集を妨げています。最近、多くの研究により、ヒト多能性幹細胞(PSC)は、異なる誘導プロトコルを使用して網膜オルガノイド(RO)に分化できることが示されており、網膜症において、疾患モデリング、薬物スクリーニング、および幹細胞ベースの治療に大きな可能性を秘めています。この研究は、小胞化と融合の可能性を大幅に減らし、60日目までの産生の成功率を高める神経網膜(NR)を生成するための最適化された誘導プロトコルについて説明します。解離後にPSCが自己再編成する能力と、特定の相補的要因を組み合わせることで、この新しい方法はNRの分化を特異的に促進することができます。さらに、このアプローチは複雑で費用対効果が高く、顕著な再現性と効率を示し、網膜疾患の個別化モデルに有望な見通しを示し、細胞治療、薬物スクリーニング、遺伝子治療検査などのアプリケーションに豊富な細胞リザーバーを提供します。
哺乳類の眼では、網膜が主要な視覚感覚組織であり、ヒトの感覚器官の中では眼が主要な情報源となっている1。網膜症は、眼疾患の主要な原因の1つであり、失明につながります2。世界では約285万人が網膜症によるさまざまな程度の視力障害に苦しんでいます3。したがって、その病因を調査することは、早期診断とタイムリーな治療のために重要です。ヒト網膜症に関するほとんどの研究は、主に動物モデルに焦点を当てています4,5,6。しかし、ヒトの網膜は、さまざまな種類の細胞からなる複雑で多層的な組織です。従来の2次元(2D)細胞培養および動物モデルシステムは、通常、天然のヒト網膜の正常な時空間発生と薬物代謝を忠実に再現することができません7,8。
最近では、多能性幹細胞(PSC)から組織様臓器を作製する3D培養技術が進化しています9,10。3D浮遊培養系でヒトPSCから作製された網膜オルガノイド(RO)は、7種類の網膜細胞を含むだけでなく、in vivoでヒト網膜に類似した明確な層状構造を示します11,12,13。ヒトPSC由来ROは人気を博し、広く入手可能であり、現在、ヒト網膜の発症と疾患を研究するための最良のin vitroモデルです14,15。過去数十年にわたり、多くの研究者が、胚性幹細胞(ESC)や人工多能性幹細胞(iPS細胞)などのヒトPSCが、さまざまな誘導プロトコルを使用してROに分化できることを実証してきました。これらの進歩は、網膜症において、疾患モデリング、薬物スクリーニング、幹細胞ベースの治療に大きな可能性を秘めています16,17,18。
しかし、ヒト多能性幹細胞(PSC)から神経網膜(NR)を作製することは、複雑で煩雑で時間のかかるプロセスです。さらに、組織オルガノイドのバッチ間のばらつきは、結果の再現性の低下につながる可能性があります19,20。網膜オルガノイド(RO)の収量には、出発細胞の数や種、転写因子や低分子化合物の使用など、多くの内因性および外因性因子が影響を与える可能性があります21,22,23。最初のヒトROが笹井研究室11によって生成されて以来、誘導プロセスの容易さと有効性を高めるために、長年にわたって複数の修正が提案されてきました13,21,24,25。残念ながら、今日まで、すべてのラボでROを生成するためのゴールドスタンダードプロトコルは確立されていません。実際、異なる誘導方法に起因するROにはある程度の不一致があり、網膜マーカーの発現とその構造の堅牢性には大きなばらつきがあります22,26。これらの問題は、サンプル収集と研究結果の解釈を著しく複雑にする可能性があります。したがって、RO生成の不均一性を最小限に抑えて効率を最大化するには、より統合された堅牢な微分プロトコルが必要です。
この研究では、Kuwahara et al.12 と Döpper et al.27 の組み合わせに基づいて最適化された誘導プロトコルと詳細な手順について説明します。この新しい方法は、オルガノイドの小胞化と融合の可能性を大幅に減らし、NRの生成の成功率を高めます。この開発は、網膜疾患の疾患モデリング、薬物スクリーニング、細胞治療への応用に大きな期待が寄せられています。
ヒトROは、胎児網膜の発達を空間的および時間的に再現することができ、初期のROは、同等の発達段階において胎児の網膜と高度の類似性を示す15。組織の形態と分子発現の点で、ヒトROは網膜組織の実際の成長状態を厳密に反映しており、疾患モデリング、薬物スクリーニング、再生医療の分野で途方もなく前例のない機会を提供します。現在、 in vitroでヒトPSCからRO…
The authors have nothing to disclose.
何一つ。
0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
Taurine | Sigma | T0625-10G | |
Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |