인간 호중구에서 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하기 위한 실시간 고처리량 기법
Summary
당사는 막 투과성 의존성 이중 염료 접근법과 결합된 살아있는 세포 분석 시스템을 활용하여 호중구 세포외 트랩(NET)을 정량화하는 자동화된 고처리량 방법을 제시합니다.
Abstract
호중구는 선천성 면역 체계의 중요한 부분을 형성하는 골수성 계통 세포입니다. 지난 10년 동안 호중구는 항균 방어에 중요한 구조인 호중구 세포외 트랩(NET)의 형성을 포함한 여러 메커니즘을 통해 면역 조절 장애의 시작 및 영속에 기여함으로써 암, 자가면역 질환 및 다양한 급성 및 만성 염증 상태의 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다. 편향되지 않고 재현 가능하며 효율적인 방식으로 NET 형성을 정량화하는 기술의 한계로 인해 건강과 질병에서 호중구의 역할을 더 깊이 이해할 수 있는 능력이 제한되었습니다. 세포 내 및 세포 외 DNA를 이미지화하기 위해 두 가지 다른 DNA 염료를 사용하는 막 투과성 의존적 이중 염료 접근 방식과 결합된 살아있는 세포 이미징 플랫폼을 사용하여 NET 형성을 진행 중인 호중구를 정량화하는 자동화된 실시간 고처리량 방법을 설명합니다. 이 방법론은 호중구 생리학을 평가하고 NET 형성을 표적으로 할 수 있는 분자를 테스트하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
호중구 세포외 트랩(NET)은 다양한 염증 자극에 반응하여 호중구에서 압출된 거미줄 모양의 염색질 구조입니다. NET은 DNA, 히스톤 및 다양한 항균 단백질/펩타이드로 구성되어 감염성 병원체를 포획하여 죽이고 염증 반응을 유발합니다1.
NET은 병원균에 대한 숙주 방어에 도움이 되지만, 다양한 자가면역질환2, 혈전증3, 대사질환4, 암5의 전이성 성장의 잠재적 동인으로 주목받고 있다. 따라서 NET 형성 억제는 이러한 질병에 대한 잠재적인 치료 옵션입니다. 그러나, 개발6에서 일부 유망한 NETs-표적 분자에도 불구하고, 이 메커니즘에 특이적으로 영향을 미치는 승인된 치료법은 아직 없다. 이는 적어도 부분적으로는 NET 형성을 위한 객관적이고, 편향되지 않고, 재현 가능하고, 처리량이 많은 정량화 방법이 부족하기 때문입니다.
우리는 이중 색상 라이브 셀 이미징 플랫폼 7,8을 활용하는 새로운 방법을 수립하고 보고했습니다. 막 투과성 핵 염료 및 막 불투과성 DNA 염료로 염색된 호중구의 타임 랩스 이미지는 소프트웨어에 의해 분석되며, NET 형성 전후 호중구의 수는 여러 시점에서 계산됩니다. PKCα 매개 라민 B 및 CDK4/6 매개 라민 A/C 분해9의 조절에 의해 NET 형성 중에 원형질막의 무결성이 손실되기 때문에, NET 형성 호중구는 막불침투성 DNA 염료에 의해 염색되는 반면 건강한 호중구는 그렇지 않습니다. 이 방법은 NET 형성을 정량화하기 위해 이전에 보고된 기술의 문제를 극복하고 자동화된 방식으로 편향되지 않고 처리량이 높으며 재현 가능하고 정확한 NET 정량화를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
NET을 생체 외(ex vivo)로 정량화하는 현재의 방법에는 호중구, NET 및 잠재적 치료 표적을 편향되지 않은 고처리량 방식으로 연구하는 능력을 제한하는 몇 가지 단점이 있습니다10,14. 예를 들어, NET의 정량화를 위한 황금 표준으로 간주되는 면역형광 염색 후 NET-형성 세포의 직접 계수는 처리량이 낮고 작업자의 주관적인 관점에 따라 달라집니다. 막?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)의 과학 기술 사무소(Office of Science and Technology)의 광 이미징 부서(Light Imaging Section)에 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, ZIA AR041199)의 국립 관절염 및 근골격 및 피부 질환 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)의 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program)의 지원을 받았습니다.
Materials
| AKT inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
| Clear 96-well plate | Corning | 3596 | |
| Live cell analysis system | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Membrane-impermeable DNA green dye | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophil pellet becomes bluish after staining. |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI can be used. |
References
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