Real-time High Throughput Technique til kvantificering af dannelse af neutrofile ekstracellulære fælder i humane neutrofiler
Summary
Vi præsenterer en automatiseret high-throughput metode til kvantificering af neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) ved hjælp af levende celleanalysesystem kombineret med en membranpermeabilitetsafhængig dual-dye tilgang.
Abstract
Neutrofiler er myeloide afstamningsceller, der udgør en afgørende del af det medfødte immunsystem. Det sidste årti har afsløret yderligere nøgleroller, som neutrofiler spiller i patogenesen af kræft, autoimmune sygdomme og forskellige akutte og kroniske inflammatoriske tilstande ved at bidrage til initiering og opretholdelse af immundysregulering gennem flere mekanismer, herunder dannelsen af neutrofile ekstracellulære fælder (NET’er), som er strukturer, der er afgørende for antimikrobielt forsvar. Begrænsninger i teknikker til at kvantificere NET-dannelse på en upartisk, reproducerbar og effektiv måde har begrænset vores evne til yderligere at forstå neutrofilers rolle i sundhed og sygdomme. Vi beskriver en automatiseret, realtids, high-throughput metode til kvantificering af neutrofiler, der gennemgår NET-dannelse ved hjælp af en levende cellebilleddannelsesplatform kombineret med en membranpermeabilitetsafhængig dual-dye-tilgang ved hjælp af to forskellige DNA-farvestoffer til afbildning af intracellulært og ekstracellulært DNA. Denne metode er i stand til at hjælpe med at vurdere neutrofil fysiologi og testmolekyler, der kan målrette NET-dannelse.
Introduction
Neutrofile ekstracellulære fælder (NET’er) er weblignende kromatinstrukturer ekstruderet fra neutrofiler som reaktion på forskellige inflammatoriske stimuli. NETs består af DNA, histoner og forskellige antimikrobielle proteiner / peptider, som fanger og dræber infektiøse patogener og påkalder inflammatoriske reaktioner1.
Mens NETs er gavnlige for værtsforsvar mod patogener, har de samlet opmærksomhed som en potentiel drivkraft for forskellige autoimmune sygdomme2, trombose3, metaboliske sygdomme4 og metastatisk vækst af kræft5. Som sådan er hæmning af NET-dannelse en potentiel terapeutisk mulighed for disse sygdomme. På trods af nogle lovende NETs-målretningsmolekyler under udvikling6 er der stadig ingen godkendt terapi, der specifikt påvirker denne mekanisme. Dette skyldes, i det mindste delvist, manglen på objektive, upartiske, reproducerbare og kvantificeringsmetoder med høj kapacitet til NET-dannelse.
Vi etablerede og rapporterede en ny metode ved hjælp af en tofarvet live-cellebilleddannelsesplatform 7,8. Time-lapse-billeder af neutrofiler farvet med membrangennemtrængeligt nukleært farvestof og membranuigennemtrængeligt DNA-farvestof analyseres af softwaren, og antallet af præ- og post-NET-dannende neutrofiler tælles på flere tidspunkter. Da plasmamembranens integritet går tabt under NET-dannelse ved regulering af PKCα-medieret Lamin B og CDK4/6-medieret Lamin A/C-demontering9, farves NET-dannende neutrofiler af membranuigennemtrængeligt DNA-farvestof, mens sunde neutrofiler ikke er. Denne metode overvinder problemerne med tidligere rapporterede teknikker til kvantificering af NET-dannelse og giver upartisk, høj kapacitet, reproducerbar og nøjagtig NET-kvantificering på en automatiseret måde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuværende metoder til kvantificering af NETs ex vivo har flere ulemper, der begrænser vores evne til at studere neutrofiler, NET’er og potentielle terapeutiske mål på en upartisk og high-throughput måde10,14. For eksempel er direkte tælling af NET-dannende celler efter immunofluorescerende farvning, der betragtes som guldstandarden for kvantificering af NET’er, lav gennemstrømning og afhængig af operatørens subjektive opfattelse. Et pladeassay, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Light Imaging Section i Office of Science and Technology ved National Institute of Arthritis og Muskuloskeletale og hudsygdomme i National Institutes of Health. Denne forskning blev støttet af det intramurale forskningsprogram fra National Institute of Arthritis og muskuloskeletale og hudsygdomme i National Institutes of Health (ZIA AR041199).
Materials
| AKT inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
| Clear 96-well plate | Corning | 3596 | |
| Live cell analysis system | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Membrane-impermeable DNA green dye | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophil pellet becomes bluish after staining. |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI can be used. |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288 (2022).
- Wagner, D. D., Heger, L. A. Thromboinflammation: From atherosclerosis to COVID-19. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 42 (9), 1103-1112 (2022).
- Njeim, R., et al. NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications. J Mol Endocrinol. 65 (4), R65-R76 (2020).
- De Meo, M. L., Spicer, J. D. The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis. Semin Immunol. 57, 101595 (2021).
- Nakabo, S., Romo-Tena, J., Kaplan, M. J. Neutrophils as drivers of immune dysregulation in autoimmune diseases with skin manifestations. J Invest Dermatol. 142 (3 Pt B), 823-833 (2022).
- Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).
- Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. Quantification of neutrophils undergoing NET formation and distinguishing mechanisms of neutrophil cell death by use of a high-throughput method. Methods Mol Biol. 2543, 129-140 (2022).
- Singh, J., et al. Moonlighting chromatin: when DNA escapes nuclear control. Cell Death Differ. 30 (4), 861-875 (2023).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Induction and quantification of NETosis. Curr Protoc Immunol. 115, 14.41.11-14.41.14 (2016).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. J Vis Exp. (175), 62837 (2021).
- Neubert, E., et al. Serum and serum albumin inhibit in vitro formation of neutrophil extracellular traps (NETs). Front Immunol. 10, 12 (2019).
- von Kockritz-Blickwede, M., Chow, O. A., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
