Realtidsteknik med hög genomströmning för att kvantifiera bildandet av neutrofila extracellulära fällor i humana neutrofiler
Summary
Vi presenterar en automatiserad metod med hög genomströmning för att kvantifiera neutrofila extracellulära fällor (NET) med hjälp av det levande cellanalyssystemet, i kombination med en membranpermeabilitetsberoende dual-dye-metod.
Abstract
Neutrofiler är myeloida celler som utgör en viktig del av det medfödda immunförsvaret. Det senaste decenniet har avslöjat ytterligare nyckelroller som neutrofiler spelar i patogenesen av cancer, autoimmuna sjukdomar och olika akuta och kroniska inflammatoriska tillstånd genom att bidra till initiering och vidmakthållande av immundysreglering genom flera mekanismer, inklusive bildandet av neutrofila extracellulära fällor (NET), som är strukturer som är avgörande för antimikrobiellt försvar. Begränsningar i tekniker för att kvantifiera NET-bildning på ett opartiskt, reproducerbart och effektivt sätt har begränsat vår förmåga att ytterligare förstå neutrofilers roll i hälsa och sjukdomar. Vi beskriver en automatiserad, realtidsmetod med hög genomströmning för att kvantifiera neutrofiler som genomgår NET-bildning med hjälp av en levande cellavbildningsplattform i kombination med en membranpermeabilitetsberoende dubbelfärgningsmetod som använder två olika DNA-färgämnen för att avbilda intracellulärt och extracellulärt DNA. Denna metodik kan hjälpa till att bedöma neutrofilfysiologi och testa molekyler som kan rikta in sig på NET-bildning.
Introduction
Neutrofila extracellulära fällor (NET) är nätliknande kromatinstrukturer som extruderas från neutrofiler som svar på olika inflammatoriska stimuli. NET består av DNA, histoner och olika antimikrobiella proteiner/peptider, som fångar och dödar infektiösa patogener och framkallar inflammatoriska svar1.
Även om NET är fördelaktiga för värdförsvar mot patogener, har de fått uppmärksamhet som en potentiell drivkraft för olika autoimmuna sjukdomar2, trombos3, metabola sjukdomar4 och metastaserad tillväxt av cancer5. Hämning av NET-bildning är därför ett potentiellt behandlingsalternativ för dessa sjukdomar. Men trots några lovande NETs-riktade molekyler under utveckling6 finns det fortfarande ingen godkänd terapi som specifikt påverkar denna mekanism. Detta är, åtminstone delvis, hänförligt till bristen på objektiva, opartiska, reproducerbara och storskaliga kvantifieringsmetoder med hög genomströmning för NET-bildning.
Vi etablerade och rapporterade en ny metod som använder en tvåfärgsplattform för avbildning av levande celler 7,8. Time-lapse-bilder av neutrofiler färgade med membranpermeabelt kärnfärgämne och membranogenomträngligt DNA-färgämne analyseras av programvaran, och antalet pre- och post-NET-bildande neutrofiler räknas vid flera tidpunkter. Eftersom plasmamembranets integritet går förlorad under NET-bildning genom reglering av PKCα-medierad Lamin B- och CDK4/6-medierad Lamin A/C-demontering9, färgas NET-bildande neutrofiler av membranogenomträngligt DNA-färgämne medan friska neutrofiler inte färgas. Denna metod övervinner problemen med tidigare rapporterade tekniker för att kvantifiera NET-bildning och ger opartisk, hög genomströmning, reproducerbar och exakt NET-kvantifiering på ett automatiserat sätt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuvarande metoder för att kvantifiera NET ex vivo har flera nackdelar som begränsar vår förmåga att studera neutrofiler, NET och potentiella terapeutiska mål på ett opartiskt och storskaligt sätt10,14. Till exempel är direkt räkning av NET-bildande celler efter immunofluorescensfärgning, som anses vara guldstandarden för kvantifiering av NET, låg genomströmning och beroende av operatörens subjektiva syn. En plattanalys som detekterar fluor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Light Imaging Section i Office of Science and Technology vid National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health. Denna forskning stöddes av det intramurala forskningsprogrammet vid National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases vid National Institutes of Health (ZIA AR041199).
Materials
| AKT inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
| Clear 96-well plate | Corning | 3596 | |
| Live cell analysis system | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Membrane-impermeable DNA green dye | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophil pellet becomes bluish after staining. |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI can be used. |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288 (2022).
- Wagner, D. D., Heger, L. A. Thromboinflammation: From atherosclerosis to COVID-19. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 42 (9), 1103-1112 (2022).
- Njeim, R., et al. NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications. J Mol Endocrinol. 65 (4), R65-R76 (2020).
- De Meo, M. L., Spicer, J. D. The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis. Semin Immunol. 57, 101595 (2021).
- Nakabo, S., Romo-Tena, J., Kaplan, M. J. Neutrophils as drivers of immune dysregulation in autoimmune diseases with skin manifestations. J Invest Dermatol. 142 (3 Pt B), 823-833 (2022).
- Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).
- Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. Quantification of neutrophils undergoing NET formation and distinguishing mechanisms of neutrophil cell death by use of a high-throughput method. Methods Mol Biol. 2543, 129-140 (2022).
- Singh, J., et al. Moonlighting chromatin: when DNA escapes nuclear control. Cell Death Differ. 30 (4), 861-875 (2023).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Induction and quantification of NETosis. Curr Protoc Immunol. 115, 14.41.11-14.41.14 (2016).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. J Vis Exp. (175), 62837 (2021).
- Neubert, E., et al. Serum and serum albumin inhibit in vitro formation of neutrophil extracellular traps (NETs). Front Immunol. 10, 12 (2019).
- von Kockritz-Blickwede, M., Chow, O. A., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
