Questo protocollo descrive un metodo per indurre una lesione alcalina corneale e limbare accurata e riproducibile in un modello murino. Il protocollo è vantaggioso in quanto consente una lesione uniformemente distribuita alla cornea e al limbus del topo altamente curvi.
La cornea è fondamentale per la vista e la guarigione corneale dopo un trauma è fondamentale per mantenerne la trasparenza e la funzione. Attraverso lo studio di modelli di lesioni corneali, i ricercatori mirano a migliorare la loro comprensione di come la cornea guarisce e sviluppare strategie per prevenire e gestire le opacità corneali. Il danno chimico è uno dei modelli di lesione più popolari che è stato ampiamente studiato sui topi. La maggior parte dei ricercatori precedenti ha usato una carta piatta imbevuta di idrossido di sodio per indurre lesioni corneali. Tuttavia, l’induzione di lesioni corneali e limbari utilizzando carta da filtro piatta non è affidabile, poiché la cornea del topo è altamente curva. Qui, presentiamo un nuovo strumento, un punzone da biopsia modificato, che consente ai ricercatori di creare una lesione alcalina ben circoscritta, localizzata e uniformemente distribuita alla cornea e al limbus murino. Questo metodo punch-trephine consente ai ricercatori di indurre un’ustione chimica accurata e riproducibile all’intera cornea murina e al limbus, lasciando altre strutture, come le palpebre, inalterate dalla sostanza chimica. Inoltre, questo studio introduce una tecnica di enucleazione che preserva la caruncola mediale come punto di riferimento per l’identificazione del lato nasale del globo. Anche la congiuntiva bulbare e palpebrale e la ghiandola lacrimale vengono mantenute intatte con questa tecnica. Gli esami oftalmologici sono stati eseguiti tramite biomicroscopio con lampada a fessura e colorazione con fluoresceina nei giorni 0, 1, 2, 6, 8 e 14 dopo l’infortunio. I risultati clinici, istologici e immunoistochimici hanno confermato il deficit di cellule staminali limbari e il fallimento della rigenerazione della superficie oculare in tutti i topi sperimentali. Il modello di lesione corneale alcalina presentato è ideale per studiare il deficit di cellule staminali limbari, l’infiammazione corneale e la fibrosi. Questo metodo è adatto anche per studiare l’efficacia preclinica e clinica dei farmaci oftalmologici topici sulla superficie corneale murina.
La cornea è fondamentale per la visione e presenta caratteristiche uniche, tra cui la trasparenza, che è un prerequisito per una visione chiara. Oltre a svolgere un importante ruolo protettivo, la cornea rappresenta i 2/3 del potere refrattivo dell’occhio1. A causa del suo ruolo significativo nella vista, le lesioni corneali e l’opacità causano un significativo declino visivo e sono responsabili della seconda causa di cecità prevenibile in tutto il mondo 2,3. Nelle lesioni corneali con grave disfunzione limbare, la funzione barriera del limbus diminuisce, con conseguente migrazione delle cellule congiuntivali verso la superficie corneale e la congiuntivalizzazione corneale 4,5, che compromette drammaticamente la vista. Sono quindi necessarie strategie preventive e terapeutiche efficaci per affrontare l’onere globale della cecità corneale e della disabilità correlata.
L’attuale comprensione del processo di guarigione delle ferite corneali umane si basa su studi precedenti che hanno indagato le risposte corneali a varie lesioni. Diverse tecniche e modelli animali sono stati impiegati per indurre varie lesioni corneali chimiche o meccaniche 6,7,8,9 e per indagare vari aspetti del processo di guarigione delle ferite corneali.
Il modello di ustione alcalina è un modello di lesione ben consolidato che viene eseguito applicando idrossido di sodio (NaOH) direttamente sulla superficie corneale o utilizzando carta da filtro piatta10. Una lesione alcalina provoca il rilascio di mediatori pro-infiammatori e l’infiltrazione di cellule polimorfonucleate non solo nella cornea e nella camera anteriore dell’occhio, ma anche nella retina. Ciò induce l’apoptosi involontaria delle cellule gangliari retiniche e l’attivazione delle cellule CD45+ 11. Pertanto, è fondamentale localizzare con precisione il sito della lesione per evitare lesioni involontarie eccessive utilizzando un modello di lesione alcalina.
La lunghezza assiale del bulbo oculare murino è di circa 3 mm12. A causa di questa breve distanza tra la cornea e la retina, esiste una curvatura corneale ripida per fornire un elevato potere di rifrazione per focalizzare la luce sulla retina (Figura 1A). Come abbiamo riportato in precedenza13, indurre lesioni chimiche a questa superficie altamente curva utilizzando una carta da filtro piatta è difficile, in particolare al limbus (Figura 1B). L’induzione di lesioni al limbus richiede l’inclinazione della carta da filtro, che ha il potenziale per causare lesioni involontarie al fornice e alla congiuntiva adiacente14. Un altro approccio prevede l’applicazione diretta dell’agente chimico sotto forma di gocce sulla superficie corneale. Tuttavia, questo metodo manca di controllo sul tempo di esposizione e c’è un potenziale rischio di indurre lesioni alla congiuntiva, al fornice e alle palpebre a causa della diffusione del liquido in queste aree.
Per superare queste limitazioni, questo studio presenta un nuovo metodo punch-trephine per indurre lesioni. Questa tecnica presenta diversi vantaggi, tra cui (i) l’induzione di un’efficace lesione chimica all’intera superficie corneale e al limbus nel modello murino, (ii) l’induzione di una lesione localizzata e ben circoscritta alla cornea, (iii) la possibilità di applicare qualsiasi liquido di interesse per una durata predeterminata e (iv) la capacità di indurre lesioni corneali di diverse dimensioni selezionando punzoni bioptici appropriati. Questo metodo è fattibile anche per i modelli di lesioni di ratto e coniglio, che presentano anche una superficie corneale curva e sono modelli animali comuni utilizzati per studiare la guarigione delle ferite della superficie oculare.
Questo studio propone un dispositivo innovativo, il punch-trephine, che può essere utilizzato per indurre con successo una lesione corneale e limbare efficace e riproducibile in un modello murino. Questo modello di deficit di cellule staminali limbari è ideale per studiare le dinamiche della guarigione delle ferite corneali e della congiuntivalizzazione dopo una lesione.
L’evidenza suggerisce che sia la nicchia limbare che la parte centrale della cornea murina contengono cellule staminali30. Pertanto, è necessaria un’efficiente lesione corneale e limbare per produrre un modello di deficit di cellule staminali e il modello di lesione qui presentato consente l’esposizione del limbus corneale curvo a un agente chimico per un periodo specifico. Per determinare la migliore concentrazione e durata della lesione da NaOH, le lesioni sono state inflitte con varie concentrazioni e durate di NaOH. Concentrazioni più elevate di NaOH o durate di esposizione più lunghe hanno provocato un aumento del danno tissutale e della fibrosi. Pertanto, i ricercatori possono regolare questi parametri in base agli obiettivi specifici del loro studio e alla gravità desiderata della lesione.
Per riprodurre con successo questo modello di lesione corneale e limbare, è necessario considerare diverse considerazioni chiave. Innanzitutto, è imperativo misurare il diametro da limbo a limbare dell’occhio bersaglio per determinare la dimensione appropriata del punzone. Si consiglia di selezionare un punzone per biopsia con un diametro esterno di 0,5 – 1 mm più grande di questo diametro.
La tensione superficiale del liquido utilizzato è un fattore importante per prevenire la fuoriuscita all’interfaccia tra la superficie oculare e il bordo della trefina del punzone, come mostrato nella Figura 1G. Pertanto, non è necessario applicare pressione sulla punta della biopsia del punzone.
Per evitare di causare danni meccanici al tessuto, è fondamentale tenere la trefina del punzone in un asse parallelo con l’occhio e astenersi dall’applicare pressione sul limbus. Una regolazione impropria dell’asse della trefina del punzone può aumentare il rischio di perdite e provocare un sito decentrato di lesioni e risultati imprecisi.
Alcune potenziali limitazioni di questa tecnica includono la necessità di selezionare la dimensione appropriata del punzone, l’acquisizione di competenza nel tenere la trefina del punzone e il potenziale rischio di causare lesioni meccaniche. Tuttavia, queste limitazioni possono essere superate attraverso la pratica e seguendo le istruzioni delineate in questo protocollo. Il ceppo e la fascia di età dei topi sono altri fattori che influenzano il processo di riepitelizzazione e devono essere considerati nello studio.
Inoltre, il protocollo proposto è vantaggioso in quanto descrive in dettaglio un metodo di enucleazione che preserva la congiuntiva bulbare e palpebrale e consente la determinazione della parte nasale del globo senza l’applicazione di suture chirurgiche come marcatore. Ricerche precedenti hanno indicato che la regione nasale dell’occhio possiede l’innervazione neurale più bassa rispetto ad altre aree della cornea, il che la rende più vulnerabile alla neovascolarizzazione e alla ridotta efficacia rigenerativa 31,32.
In sintesi, i segni clinici della LSCD, come l’opacità corneale (CO), i difetti epiteliali persistenti e la neovascolarizzazione corneale (NV), insieme ai cambiamenti istologici osservati, tra cui la metaplasia delle cellule caliciformi, l’espressione di K13 sulla superficie corneale e l’assenza di K12 sulla superficie corneale, confermano la presenza di LSCD in questo modello. Questi risultati forniscono la prova che questa nuova tecnica è efficace nell’indurre LSCD. Questo modello di danno chimico può essere impiegato in studi preclinici per studiare nuovi farmaci e trattamenti farmaceutici nel campo della lesione e della rigenerazione corneale.
The authors have nothing to disclose.
Riconosciamo che NEI P30-EY026877 supporta questa ricerca. Ringraziamo Charlene Wang e il Dr. Irv Weissman Lab presso l’Istituto per la Biologia delle Cellule Staminali e la Medicina Rigenerativa dell’Università di Stanford per tutta la loro gentile assistenza nel fornire animali da esperimento. Apprezziamo l’assistenza di Hirad Rezaeipoor nella preparazione e nella modifica delle immagini.
Anti-K12 antibody | ABCAM | ab185627 | |
Anti-K13 antibody | ABCAM | ab92551 | |
Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher Scientific | B14 | |
C57BL/6 mice | Dr Weissman Lab, Stanford University | ||
Curved forceps | Storz | E1885 | |
Disposable 90 degree bent needle | |||
Disposable biopsy punch | Med blades | ||
Donkey anti-rabbit IgG H&L | ABCAM | ab150073 | |
Ethanol | ThermoFisher Scientific | T038181000CS | |
Ethiqa XR (Buprenorphine extended-release injectable suspension) | Fidelis Animal Health | ||
Heating pad for mouse | |||
Ketamine hydrochloride | Ambler | ANADA 200-055 | |
OCT | Tissue-Tek 4583 | ||
Ophthalmic surgical scissors | |||
pH Indicator Sticks | Whatman | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | AM9624 | |
Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
Slit-lamp microscope | NIDEK | SL-450 | |
Sodium fluorescein AK-fluor 10% | Dailymed | NDC17478-253-10 | |
Sterile irrigation solution (BSS) | Alcon | 9017036-0119 | |
Sterile syringe, 1 and 5 ml | |||
Straight forceps | Katena K5 | 4550- Storz E1684 | |
Surgical eye spears | American White 17240 Cross | ||
Surgical microscope | Zeiss S5 microscope | ||
Tetracaine ophthalmic drop | Alcon | NDC0065-0741-14 | |
Timer | |||
Triple antibiotic ophthalmic ointment | Bausch and Lomb | ||
TritonX -100 | Fisher Scientific | 50-295-34 | |
Two-speed rotary tool | 200-1/15 Two Speed Rotary Toolkit | ||
Xylazine | AnaSed | NADA#139-236 |