Summary

Introduzione all'elaborazione, all'adattamento e all'interpretazione dei dati di assorbimento transitorio

Published: February 16, 2024
doi:

Summary

Questo protocollo è un punto di partenza per principianti nell’elaborazione, nell’adattamento e nell’interpretazione degli spettri di assorbimento transitorio. L’obiettivo di questo protocollo è la preparazione di set di dati e l’adattamento utilizzando sia la cinetica a singola lunghezza d’onda che l’analisi del tempo di vita globale. Vengono discusse le sfide associate ai dati di assorbimento transitorio e al loro adattamento.

Abstract

La spettroscopia di assorbimento transitorio (TA) è un potente metodo spettroscopico risolto nel tempo utilizzato per tracciare l’evoluzione dei processi di stato eccitato attraverso cambiamenti nello spettro di assorbimento del sistema. Le prime implementazioni di TA erano limitate a laboratori specializzati, ma l’evoluzione dei sistemi commerciali chiavi in mano ha reso la tecnica sempre più disponibile per i gruppi di ricerca di tutto il mondo. I moderni sistemi TA sono in grado di produrre grandi set di dati ad alta risoluzione energetica e temporale ricchi di informazioni fotofisiche. Tuttavia, l’elaborazione, l’adattamento e l’interpretazione degli spettri TA possono essere difficili a causa del gran numero di caratteristiche dello stato eccitato e degli artefatti strumentali. Molti fattori devono essere attentamente considerati durante la raccolta, l’elaborazione e l’adattamento dei dati TA al fine di ridurre l’incertezza su quale modello o insieme di parametri di adattamento descriva meglio i dati. L’obiettivo della preparazione e dell’adattamento dei dati è quello di ridurre il maggior numero possibile di questi fattori estranei, preservando al contempo i dati per l’analisi. In questo metodo, ai principianti viene fornito un protocollo per l’elaborazione e la preparazione dei dati TA, nonché una breve introduzione alle procedure e ai modelli di fitting selezionati, in particolare l’adattamento a lunghezza d’onda singola e l’analisi della durata globale. Viene fornito un commento su una serie di sfide comuni nella preparazione dei dati e sui metodi per affrontarle, seguito da una discussione delle sfide e dei limiti di questi semplici metodi di adattamento.

Introduction

La spettroscopia di assorbimento transitorio (TA) è una tecnica spettroscopica risolta nel tempo che monitora l’evoluzione delle specie fotoeccitate attraverso cambiamenti dipendenti dal tempo del loro spettro di assorbimento in seguito all’eccitazione con un impulso di luce. Poiché l’AT è una tecnica di assorbimento, i segnali spettroscopici che derivano da stati che subiscono sia transizioni radiative (cioè stati che tipicamente emettono un fotone) che transizioni non radiative (stati che sono tipicamente non fluorescenti e subiscono conversione interna, incrocio intersistemico o partecipano a fotoreazioni) possono essere identificati e la loro evoluzioneseguita 1,2. A seconda delle specifiche della sorgente di eccitazione e del metodo di rilevamento, TA consente l’accesso alla cinetica dai femtosecondi ai microsecondi e dall’UV all’infrarosso lontano, rendendolo uno strumento spettroscopico versatile. La commercializzazione degli spettrometri TA è progredita in modo significativo negli ultimi decenni, portando un maggior numero di laboratori e strutture ad avere accesso a questa potente tecnica2.

I moderni sistemi TA sono in grado di produrre grandi set di dati con un’elevata risoluzione energetica e temporale. I set di dati assumono generalmente la forma di una matrice 2D di valori di differenza di trasmittanza o assorbanza in funzione della lunghezza d’onda e del ritardo temporale rispetto all’impulso di eccitazione. Questo set di dati può essere visualizzato come una mappa termica bidimensionale o una mappa topografica tridimensionale. L’interpretazione di questi dati è diventata più complessa man mano che i ricercatori si sforzano di includere l’intero set di dati quando generano adattamenti che descrivono al meglio il loro sistema di interesse3.

Sebbene l’AT possa coprire un’ampia gamma di lunghezze d’onda e scale temporali, questo protocollo si concentra su una delle sue forme più ampiamente accessibili4: la spettroscopia a banda larga nella regione UV-visibile guidata da un laser pulsato a femtosecondi. Uno schema 5,6 di tale strumento è riportato nella Figura 1. L’esperimento inizia prendendo un impulso dal laser e dividendolo in due copie. Una copia dell’impulso, chiamata “pompa”, viene utilizzata per eccitare il campione. Un dispositivo come un amplificatore parametrico ottico (OPA) viene tipicamente utilizzato per trasformare l’impulso della pompa alla lunghezza d’onda di eccitazione desiderata 5,7. La seconda copia dell’impulso, chiamata “sonda”, entra in una fase di ritardo meccanico, che può variare il ritardo temporale tra gli impulsi della pompa e della sonda variando la distanza percorsa dall’impulso. L’impulso della sonda a lunghezza d’onda singola viene quindi trasformato in un continuum di luce bianca utilizzando un cristallo di zaffiro o fluoruro di calcio (CaF2)8. L’impulso di luce bianca viene fatto passare attraverso il campione e il suo spettro viene misurato utilizzando un rivelatore a banda larga come una fotocamera CCD (Charge-Coupled Device). Misurando le variazioni nello spettro dell’impulso di luce bianca con e senza la pompa, è possibile misurare le variazioni nello spettro di assorbimento del campione indotte dalla pompa, ΔA(T). I lettori interessati sono indirizzati a questa utile recensione9 per ulteriori informazioni sul processo di rilevamento.

In tutte le forme di spettroscopia TA, gli spettri ΔA(t) sono calcolati prendendo la differenza tra l’assorbimento dello stato fondamentale,sonda A, e quello dello stato eccitato,A pompa+sonda, ad un dato ritardo temporale, t, tra i due impulsi 2,5,9,10.

Equation 1(1)

Si noti che unasonda è equivalente allo spettro di assorbimento allo stato stazionario del campione ed è indipendente dal tempo; la risoluzione temporale dell’esperimento deriva dal ritardo tra la pompa e la sonda catturata in Apompa+sonda(t). Una simulazione di questi dati è mostrata nella Figura 2A.

A differenza degli spettri di assorbimento in regime stazionario, gli spettri TA possono avere caratteristiche sia positive che negative a causa della differenza presa nell’equazione 1. Le caratteristiche positive sono il risultato di nuove specie assorbenti create dall’impulso di pompa e possono rappresentare stati cromofori eccitati, stati di tripletto, riarrangiamenti geometrici, effetti di solvatazione o fotoprodotti in stato eccitato3. Nella discussione verranno presentate le linee guida generali per l’identificazione di queste caratteristiche e l’assegnazione alle specie chimiche. Le caratteristiche negative possono derivare dalla candeggina allo stato fondamentale (GSB) o dall’emissione stimolata (SE) (Figura 2B). Il GSB è dovuto alla perdita di popolazione dello stato fondamentale in seguito all’assorbimento dell’impulso di pompa. Le molecole promosse allo stato eccitato non assorbono più nella stessa regione del loro stato fondamentale; pertanto, viene assorbito meno impulso della sonda e la differenza nell’equazione 1 può essere negativa in quella regione. Il GSB è caratterizzato dall’avere la stessa forma spettrale di quello dell’assorbimento allo stato fondamentale ma con un segno opposto. I segnali SE derivano dall’emissione da una specie in stato eccitato stimolata dall’impulso della sonda3. L’emissione di queste specie fa sì che più luce raggiunga il rivelatore, il che equivale ad avere un minore assorbimento a quelle lunghezze d’onda. Il segnale SE avrà una forma spettrale simile a quella dello spettro di emissione spontanea della specie, ma con un segno negativo e un diverso peso di frequenza10.

Oltre alle informazioni sulle specie in stato eccitato, gli spettri TA possono contenere una serie di artefatti e caratteristiche estranee che possono distorcere la dinamica sottostante e oscurare l’assegnazione delle bande di assorbimento11. Il trattamento improprio di questi artefatti nella preparazione e nell’analisi dei dati può portare all’applicazione di modelli fotofisici inappropriati ai dati e, di conseguenza, a conclusioni fuorvianti11. Pertanto, la prima parte di questo protocollo si concentra su come elaborare correttamente i set di dati TA dopo che sono stati raccolti. L’obiettivo di questa sezione è quello di fornire ai ricercatori che si avvicinano per la prima volta all’AT una serie di linee guida che aiuteranno a sviluppare un’intuizione e un apprezzamento per la preparazione e l’elaborazione rigorosa dei loro dati.

Dopo l’elaborazione di un set di dati, sono disponibili una pletora di strumenti e modelli per l’adattamento e l’interpretazione degli spettri con vari livelli di complessità e rigore10. L’obiettivo della seconda sezione di questo protocollo è quello di preparare il lettore ad applicare l’adattamento a singola lunghezza d’onda e l’analisi globale ai dati e di fornire indicazioni su quando questi modelli sono appropriati per descrivere i loro dati. Il software commerciale è ora prontamente disponibile per la preparazione e il trattamento dei dati TA, come Surface Xplorer 12,13 dei sistemi Ultrafast (scaricabile e utilizzabile gratuitamente, vedere la tabella dei materiali). Altre alternative gratuite sono state rilasciate da ricercatori accademici, come Glotaran14. Glotaran è un programma software gratuito sviluppato per l’analisi globale e target di dati di spettroscopia e microscopia risolti nel tempo. Funge da interfaccia utente grafica (GUI) per il pacchetto R TIMP14. Inoltre, gli utenti possono utilizzare linguaggi di programmazione come Python per scrivere i propri codici che eseguono l’analisi. Ognuno di questi software e soluzioni di programmazione ha caratteristiche positive che li rendono contributi importanti. Ai fini di questo studio, possiamo presentare un solo software per la componente visiva di questa attività. Una discussione approfondita di ciascun software di fitting esula dallo scopo di questo articolo.

Questo articolo fornisce una procedura dettagliata per (1) l’elaborazione dei dati TA, (2) l’adattamento dei dati TA utilizzando la cinetica a singola lunghezza d’onda e l’analisi globale e (3) l’estrazione dei dati e l’adattamento ad altri modelli. È incluso un insieme di dati TA rappresentativi che il lettore può utilizzare come pratica (File supplementare 1 e File supplementare 2). I dati sono una misurazione di un campione di 165 μM di 1,4-bis(5-fenilossazolo-2-il)benzene (POPOP) in etanolo eccitato a 330 nm e raccolto in un intervallo da -5 ps a 5,5 ns. Inoltre, un campione “bianco” contenente solo etanolo e nessun campione è stato raccolto nelle stesse condizioni sperimentali in un intervallo compreso tra −5 ps e 5 ps, che viene utilizzato nella preparazione dei dati per il fitting (fase 1). Gli spettri sono stati raccolti utilizzando uno spettrometro ultraveloce ad assorbimento transitorio. Il campione è stato contenuto in una cuvetta di 2 mm di lunghezza del percorso e sottoposto a costante agitazione. La procedura di elaborazione e adattamento descritta si basa sul software Surface Xplorer che adatta i dati nel formato *.ufs e che di seguito verrà chiamato “programma di adattamento”. Sono disponibili programmi per la conversione di set di dati in altri formati in file *.ufs15. Sebbene i dettagli di questo protocollo siano specifici per Surface Xplorer, i passaggi che seguono sono generalizzabili a qualsiasi pacchetto software, commerciale o costruito in casa. Inoltre, i risultati dell’elaborazione dei dati possono essere estratti e adattati utilizzando questi altri pacchetti software. Un fascicolo informativo di supporto (fascicolo supplementare 3) fornisce ulteriori consigli sul montaggio.

Protocol

1. Preparazione dei dati per il fitting Caricare il set di dati SAMPLE nel software Fitting. I dati appariranno come mostrato nella Figura 1 supplementare. Quando la luce di eccitazione diffusa è presente all’interno della finestra di rilevamento ottico dell’esperimento, utilizzare l’opzione Sottrai luce diffusa (Figura 2 supplementare). Se nei dati non è presente alcuna luce di eccitazione diffusa, procedere al passaggio 1.5.NOTA: La luce diffusa si osserva più comunemente quando la lunghezza d’onda di eccitazione cade all’interno della finestra ottica. La luce diffusa appare come una caratteristica negativa (candeggina) nitida alla lunghezza d’onda di eccitazione (o a un certo ordine di diffrazione, o lunghezza d’onda prodotta nell’OPA) che non varia nel tempo. Fare clic sul menu Superficie , quindi fare clic sull’opzione Sottrai luce diffusa (Figura 2 supplementare). Apparirà una nuova finestra. Nella nuova finestra, fare clic sui pulsanti freccia per impostare il numero di spettri di sfondo su media (Figura 3 supplementare) per eseguire la correzione dello sfondo. L’uso di dieci spettri fornisce un buon punto di partenza e il numero può essere regolato a piacere. Fare clic su Accetta per eseguire la sottrazione (procedere al passaggio 1.7).NOTA: Gli spettri di fondo vengono ricavati dai primi spettri presenti nel set di dati e quindi si spostano in avanti temporalmente utilizzando tutti gli spettri di fondo necessari per fornire la media del segnale di fondo; Tuttavia, se ne usi troppi, si inizieranno a utilizzare spettri che contengono il segnale di interesse, quindi non usarne troppi. Con i dati dell’intervallo di tempo lungo, la funzione di dispersione potrebbe non essere visualizzata alla fine dell’intervallo di tempo dei dati. Ciò può verificarsi se l’intervallo di tempo supera il tempo di integrazione della fotocamera o per altri motivi, in base al modo in cui viene costruito l’esperimento TA. Per correggere questo problema, è possibile utilizzare l’opzione di impostazione dell’intervallo di tempo come descritto in File supplementare 3. Per i dati in cui non è presente luce diffusa all’interno della finestra ottica, fare clic sul menu Superficie , quindi fare clic sull’opzione Sottrai sfondo . Nella finestra che appare, fai clic sui pulsanti freccia in basso a destra per “Numero di spettri” da calcolare come media (scegli 10) e fai clic su Accetta.NOTA: Gli spettri di sfondo in questa opzione funzionano allo stesso modo dell’opzione “Sottrai luce diffusa”. Iniziare con dieci spettri fornisce una buona media. È possibile utilizzare più spettri, ma bisogna fare attenzione a non usarne troppi per evitare di includere spettri contenenti segnali di interesse. Il manuale dell’utente di Surface Xplorer descrive le differenze nella correzione applicata per “Sottrai luce diffusa” rispetto a. la correzione più semplice “Sottrai sfondo”. È importante applicare la correzione appropriata per l’artefatto16. I dati vicino ai bordi della finestra ottica possono avere un rapporto segnale/rumore molto basso derivante dalla forma dello spettro della sonda e/o dal campione che assorbe troppa luce bianca. I dati rumorosi in queste regioni rendono più difficile l’analisi. Rimuovi queste porzioni inutili dello spettro. Fare clic sulle lunghezze d’onda finali dello spettro (riquadro in basso a sinistra), digitare nuovi valori (Figura 4 supplementare) e fare clic su Invio. Scegliere un intervallo di lunghezze d’onda che rimuova i dati rumorosi ai bordi della finestra. Per i dati forniti, l’intervallo è compreso tra 340 e 680 nm. Finalizzare la regolazione della finestra spettrale all’intervallo di lunghezze d’onda desiderato. Fare clic sul menu Superficie , quindi fare clic su Ritaglia (Figura 5 supplementare). Apparirà una finestra pop-up.Fare clic su OK. Fare clic sul menu File , quindi fare clic su Salva file con nome. Quindi, fare clic su OK. Chiudere il set di dati.NOTA: Prestare attenzione durante il ritaglio, poiché la funzione ritaglierà i dati lungo entrambi gli assi della lunghezza d’onda e del ritardo, eliminando tutti gli altri dati. Assicurarsi che l’intervallo di tempo di ritardo contenga la parte dei dati da conservare. Inoltre, si consiglia vivamente di salvare tutti i dati ritagliati come un nuovo file etichettato in modo appropriato in modo da lasciare intatta la superficie dei dati grezzi come backup. Per i dati raccolti sulle scale temporali fs o ps, è necessario applicare una correzione chirp. Aprire la superficie dei dati con solo il solvente o il substrato (nessun campione) prelevato nello stesso set up sperimentale dei dati. Questo esempio è chiamato esecuzione dell’esperimento “vuoto”. Eseguire la stessa serie di passaggi sui dati “vuoti” (dal passaggio 1.2 al passaggio 1.8) che sono stati eseguiti sui dati di esempio.NOTA: Si consiglia vivamente di eseguire un esperimento “in bianco” nelle stesse condizioni del campione, ma con una finestra temporale più breve (ad esempio, da ~ −5 ps a 5 ps) per garantire un numero elevato di punti intorno al tempo zero. Questo ciclo “bianco” dovrebbe essere costituito solo da solvente o substrato, a seconda del tipo di campione, e viene utilizzato per stabilire la curvatura chirp. La preparazione del “blank” fino a questo punto dovrebbe seguire la stessa correzione dello sfondo e il ritaglio dei dati di esempio. Se non è stato eseguito un “vuoto”, la correzione del chirp può essere eseguita direttamente sul set di dati. Avviare il processo di correzione del cinguettio. Nel riquadro della mappa termica (in alto a sinistra), fai clic sul mirino e trascina il componente della linea verticale all’estremità blu dello spettro. Inizia sull’intervallo di lunghezze d’onda blu vicino all’inizio della finestra spettrale. Fare clic sul menu Cinetica , quindi fare clic su Adatta risposta solvente.NOTA: La risposta al solvente di adattamento deve essere eseguita solo su un campione “bianco” che non genera alcun segnale oltre il tempo zero. Se si tenta di applicare questa funzione di adattamento a un set di dati contenente dati su una molecola o un materiale di interesse, il programma tenterà di adattare i dati anziché l’IRF (funzione di risposta dello strumento). Per i campioni “vuoti”, l’unico segnale presente dovrebbe essere un artefatto coerente derivante dalla modulazione di fase incrociata. La modulazione cross-phase si verifica solo dove i fasci della pompa e della sonda si sovrappongono e, pertanto, fornisce una traccia della curvatura del chirp che può essere adattata utilizzando l’opzione “Fit Solvent Response”. Il posizionamento manuale dei punti sarà richiesto per i dati senza un “bianco” di accompagnamento da utilizzare per la correzione e sono descritti più dettagliatamente nel file supplementare 3. Si apre una nuova finestra “Adatta risposta solvente”. Fare clic sul pulsante Adatta (Figura 6 supplementare). Il fitting genererà un adattamento alla funzione di risposta dello strumento utilizzando la derivata prima e seconda di una gaussiana. Fare clic sul pulsante Salva , quindi fare clic su x per chiudere la schermata.NOTA: la linea rossa adattata deve corrispondere bene ai punti dati (quadrati vuoti blu) nell’intero intervallo di tempo, soprattutto la grande caratteristica vista vicino al tempo zero (0,1-2,0 ps). L’adattamento avrà il massimo successo se c’è un numero elevato di punti intorno al tempo zero, che può essere ottenuto utilizzando una breve finestra di ritardo per l’esperimento “vuoto” e mantenendo un numero elevato di punti. Se l’adattamento non sembra corrispondere bene ai punti dati, seleziona la casella “Aggiungi gaussiana (R0)” e riprova l’adattamento. Questa opzione aggiungerà una somma della gaussiana alla prima e alla seconda derivata e potrebbe adattarsi meglio alla forma dell’elemento IRF a questa lunghezza d’onda. Se il raccordo di risposta solvente non riesce ancora a catturare il segnale IRF, selezionare una lunghezza d’onda diversa. Esegui questo processo (passaggi 1.10-1.11) almeno cinque volte, poiché saranno necessari cinque punti per correggere correttamente un cinguettio. I punti dovrebbero essere distanziati su tutta la finestra spettrale, se possibile. Alcuni solventi/substrati potrebbero non generare un segnale osservabile in porzioni della finestra spettrale, a seconda delle condizioni sperimentali. Altri punti possono essere aggiunti/utilizzati secondo necessità per produrre una vestibilità accettabile. Al termine, chiudere il set di dati “vuoto”.NOTA: Ogni punto salvato viene scritto in un file Excel nella cartella di lavoro come una nuova riga non appena l’utente fa clic su Salva. Se viene salvato un punto indesiderato, il punto può essere rimosso dal file Excel eliminando la riga del punto indesiderato. Riapri il set di dati ritagliato e sottratto in background. Fare clic sul menu Superficie , quindi fare clic sull’opzione Correzione cinguettio . Verrà visualizzata una nuova schermata con tre finestre e un menu in basso a destra (Figura 7 supplementare). Aggiungi la correzione del cinguettio appena creata. Fare clic sull’opzione Aggiungi da file , selezionare il file Excel che termina con “coefficienti di adattamento” e fare clic su OK. L’adattamento della correzione del cinguettio viene ora visualizzato nella finestra in alto a sinistra come una linea nera con marcatori X (Figura 8 supplementare).NOTA: La correzione del cinguettio viene visualizzata come una linea continua; i marcatori X lungo la linea sono i punti generati dal processo di risposta del solvente di adattamento. I punti possono essere aggiunti manualmente regolando il puntatore a croce e facendo clic su Aggiungi. I punti possono anche essere rimossi evidenziandoli e premendo Rimuovi. Ulteriori punti possono essere modificati manualmente digitando i valori nell’elenco in basso a destra. Infine, se lo si desidera, la correzione corrente può anche essere salvata come file per essere riutilizzata in un secondo momento utilizzando il pulsante Salva su file . Fare clic sul pulsante Anteprima correzione chirp . In questo modo viene applicata temporaneamente la correzione del cinguettio. Osservare la correzione nella finestra in alto a sinistra per assicurarsi che i dati siano stati appiattiti temporalmente e che non sia più osservabile alcuna curvatura.Se sei soddisfatto della correzione del cinguettio, fai clic sul pulsante Applica ed esci . Se non si è soddisfatti, ripetere i passaggi 1.10-1.14, scegliendo più (o diverse) lunghezze d’onda per l’adattamento della correzione chirp fino ad ottenere una correzione soddisfacente.NOTA: L’applicazione della correzione del cinguettio regolerà il tempo zero sulla linea raddrizzata come appare nell’anteprima. Potrebbe esserci un disallineamento temporale tra il “vuoto” e la superficie dei dati. Fare clic sul menu File, quindi fare clic su Salva file con nome. Digitare un nome appropriato per il file per indicare che è stata applicata una correzione chirp. Quindi, fare clic su OK. Alcune feature di dispersione nei dati potrebbero non essere completamente rimosse quando si esegue la sottrazione in background. Queste caratteristiche influiscono sul fitting e producono risultati di fitting errati. Individua tali funzionalità nei dati che devono essere rimossi. La caratteristica di scattering può essere identificata più facilmente nella regione temporale negativa.Nel riquadro della mappa termica in alto a sinistra, fai clic e trascina il mirino sulla regione temporale negativa. Rimanendo all’interno della regione temporale negativa, utilizzare il mirino per determinare le lunghezze d’onda alle quali inizia e termina la funzione di scattering. Si noti l’intervallo di lunghezze d’onda della funzione di scattering (per il set di dati fornito, l’intervallo di funzionalità è compreso tra 654 nm e 672 nm).NOTA: Quando si determina se una feature deve essere rimossa, trascinare il mirino orizzontale verso l’alto e verso il basso lungo gli assi temporali per visualizzare l’intervallo spettrale della feature. Le caratteristiche di scattering hanno in genere tracce cinetiche a lunghezza d’onda singola molto rumorose, quindi la gamma spettrale della caratteristica può anche essere verificata utilizzando le tracce cinetiche. Partendo dalla lunghezza d’onda inferiore (blu) (cioè 654 nm), fare clic sulla lunghezza d’onda dell’estremità destra dello spettro (riquadro in basso a sinistra) e digitare il valore dell’estensione della caratteristica inferiore (blu). Ritaglia i dati facendo clic sul menu Superficie , quindi fai clic su Ritaglia. Fare clic su OK nel menu a comparsa. Salvare i dati ritagliati con un nome file univoco per indicare il lato dei dati (si consiglia blu o sinistra). Chiudere il file. Aprire il file con la correzione chirp applicata salvata nel passaggio 1.16. Continuate con l’estensione della lunghezza d’onda più alta (rossa) dell’elemento. Fare clic sulla lunghezza d’onda dell’estremità sinistra dello spettro (riquadro in basso a sinistra) e digitare il valore dell’estensione più alta dell’elemento. Ritaglia i dati facendo clic sul menu Superficie , quindi fai clic su Ritaglia. Fare clic su OK nel menu a comparsa. Salvare i dati ritagliati con un nome file univoco per indicare il lato dei dati (si consiglia di utilizzare il colore rosso o destro). Combinare i due file facendo clic sul menu File , quindi fare clic su Combina più superfici. Nella nuova finestra, selezionare entrambi i lati dei dati (ad esempio, Destra e Sinistra o Blu e Rosso). Usa ctrl + clic per selezionare ogni file. Verifica che entrambi i file siano selezionati nella casella “Nome file:”, quindi fai clic su OK in basso a destra. Al termine della barra di avanzamento, i dati sono stati combinati.NOTA: È possibile combinare un numero qualsiasi di file in questo modo. I dati possono essere uniti su più tagli sia nell’asse del tempo che in quello della lunghezza d’onda. Fare clic sul menu File , quindi fare clic su Salva file con nome e scegliere un nome file univoco per indicare che è combinato (consigliato Combinato o Composito). Quindi, fare clic su OK per salvare il file.NOTA: Vedere la sezione 3 per informazioni su come salvare i dati dalla finestra dei dati grezzi per la visualizzazione e la stampa successive. I dati nella mappa termica (riquadro in alto a sinistra) dovrebbero apparire come nella Figura 3 e sono ora pronti per essere adattati. La visualizzazione degli spettri rappresentativi, come mostrato nella Figura 3, è descritta al punto 3.1.2. 2. Esecuzione di un adattamento Caricare la superficie dati preparata correttamente. Decidere quale adattamento verrà eseguito e passare alla sezione appropriata.NOTA: Questo protocollo presenta due opzioni di adattamento dei dati: il passaggio 2.3 presenta l’adattamento della traccia cinetica a lunghezza d’onda singola e il passaggio 2.4 presenta l’adattamento dell’analisi globale. Raccordo a lunghezza d’onda singolaPer impostare un singolo adattamento cinetico, spostare il cursore (nei riquadri in alto o in basso a sinistra) sulla lunghezza d’onda desiderata. Fare clic sul menu Cinetica , quindi fare clic su Adatta cinetica. Per il set di dati fornito, iniziare con 632 nm. Nella nuova finestra che si apre (Figura 9 supplementare), si osservi che i parametri di adattamento principali e i valori di inizializzazione sono impostati nell’angolo in alto a sinistra della finestra, sotto il logo del programma, nella casella accanto a quest’area sotto il testo “current fit @ wavelength”. Fare clic sui pulsanti freccia per regolare il numero di durate (cioè il numero di decadimenti esponenziali utilizzati per adattare i dati) nella casella “Durate finite”. Per il set di dati fornito, scegliere 2 durate. Le vite da una a 3 sono tipiche come punto di partenza. Se il segnale dei dati si estende oltre la finestra temporale raccolta, è necessario includere una componente di durata “infinita”. Per fare ciò, fai clic sulla casella di controllo Usa durata infinita . Se i dati decadono completamente rispetto alla linea di base, non selezionare questa casella. Per il set di dati fornito, non selezionare la casella.NOTA: La “durata infinita” consente di mantenere un offset del segnale (cioè, il programma non forzerà il decadimento dell’adattamento alla linea di base). L’uso di una componente infinita è necessario quando il segnale a quella lunghezza d’onda non decade alla linea di base entro l’intervallo di tempo dell’esperimento. Immettere i valori di ipotesi per la durata e le ampiezze associate, il tempo di risposta dello strumento e il tempo zero per facilitare il processo di adattamento (Figura 10 supplementare). Fare clic sul parametro desiderato. Fare clic nella finestra del valore, digitare un valore di ipotesi, quindi fare clic sul pulsante di ipotesi iniziale per impostare il valore. Per il set di dati fornito, i valori di ipotesi appropriati sono: 0 = 0 ps, IRF = 0,25 ps, A1 = 0,6, t1 = 100 ps, A2 = 0,08, t2 = 1100 ps.NOTA: “0” è la stima del tempo zero, “IRF” è il tempo di risposta dello strumento, “A” si riferisce all’ampiezza di un dato esponenziale (vedi Equazione 3) e “t” è la costante di durata/tempo. Fornire buoni valori di ipotesi aiuta il programma a ottenere un adattamento ragionevole. Scegliere i valori “A” che rientrano nei valori dell’intervallo A nel set di dati. Scegliere i valori “t” negli intervalli di tempo in cui si osserva un cambiamento significativo nella traccia cinetica. Il modo migliore per ottenere un’intuizione su come i valori di ipotesi influenzano l’adattamento è provare diversi insiemi di valori di ipotesi e osservare gli adattamenti che producono. Se uno o più di questi parametri sono noti, tale parametro può essere impostato e “fissato” in modo che non vari con l’adattamento (Figura 11 supplementare). Una volta inseriti tutti i parametri di ipotesi, fare clic sul pulsante Adatta . Un adattamento rappresentativo è mostrato nella Figura 4.NOTA: l’applicazione dell’adattamento popolerà il grafico dei dati con la linea di adattamento e un grafico residuo che può essere utilizzato per valutare la qualità dell’adattamento. Anche i parametri di adattamento, come la durata e le ampiezze associate, il tempo zero e il tempo di risposta dello strumento, vengono inseriti nella casella in alto a sinistra. Utilizzare diversi parametri di adattamento per determinare il numero di durate e l’inclusione/esclusione di un componente di tempo “infinito” che produce il miglior adattamento ai dati. Salvare l’adattamento facendo clic sul pulsante Salva (Figura supplementare 9).NOTA: Vedere la sezione 3 per informazioni su come salvare i dati dalla finestra dei dati grezzi per la visualizzazione e la stampa successive. Raccordo per analisi globaleFate clic sul menu Superficie (Surface ), quindi fate clic sull’opzione Componenti principali tramite SVD (Principal Components via SVD ). Viene visualizzata una nuova finestra (Figura 12 supplementare).NOTA: La finestra in alto a destra visualizza le tracce cinetiche principali e in basso a sinistra gli spettri principali. Il riquadro in alto a sinistra visualizza un grafico della superficie residua creata dalla differenza tra la superficie originale e una superficie creata dai componenti principali selezionati. Fare clic sui pulsanti freccia per impostare il “Numero di componenti principali” (Figura supplementare 12). Per il set di dati fornito, scegliere 15.NOTA: Quando si decide il numero di componenti principali da scegliere, un modo è quello di continuare ad aumentare il numero fino a quando sia gli spettri principali che le tracce cinetiche principali assomigliano a un modello di rumore. Un altro modo per determinare il numero di componenti principali da scegliere consiste nell’esaminare i valori del coefficiente di peso visualizzati a sinistra della legenda nel riquadro in alto a destra. Continuare ad aggiungere i componenti principali fino a quando questo valore non raggiunge 0,01. In generale, è consigliabile aggiungerne altri oltre a questo per buona misura. Ciò può comportare la selezione di un massimo di 15 o più componenti principali. Fare clic sul pulsante Salva . I componenti principali salvati sono necessari per passare al passaggio successivo.NOTA: ogni componente principale è una rappresentazione a complessità ridotta dell’area dati originale. L’utilizzo dei componenti principali si tradurrà in una superficie semplificata rispetto ai dati grezzi analizzati. Tenere conto della maggior parte delle caratteristiche principali della superficie dei dati è molto importante per ottenere un adattamento accurato, quindi è fondamentale utilizzare un numero sufficiente di componenti principali per acquisire tali funzionalità. L’utilizzo di più componenti principali non comprometterà l’adattamento. Pertanto, in caso di dubbi sul numero di componenti principali da selezionare, utilizzare più componenti principali anziché meno. Tieni presente che l’utilizzo di troppi potrebbe rallentare il software di adattamento. Dopo aver salvato i componenti principali, il programma tornerà alla schermata principale e sarà ora possibile tentare l’adattamento globale. Fare clic sul menu Superficie , quindi fare clic sull’opzione Adattamento globale . Si aprirà una nuova finestra (Figura 13 supplementare).NOTA: le tracce cinetiche principali vengono visualizzate nel riquadro in alto a destra. Il riquadro in alto a sinistra visualizzerà una superficie della superficie di adattamento rispetto alla superficie grezza. Il riquadro in basso a sinistra visualizzerà gli spettri di differenza associati al decadimento (DADS) generati dall’adattamento. Infine, il riquadro in basso a destra è dove è possibile impostare i parametri di adattamento, incluso il numero di funzioni esponenziali da utilizzare e se utilizzare una funzione infinita. Utilizzare i pulsanti freccia accanto al “numero di exp.” per impostare il numero di funzioni esponenziali da includere nell’adattamento. Se il segnale dei dati si estende oltre la finestra temporale raccolta, è necessario includere una componente di durata “infinita”. Per fare ciò, fare clic sulla casella di controllo Usa offset (Ainf). Per il set di dati fornito, scegliere 2 e non fare clic sulla casella. Se i dati decadono completamente rispetto alla linea di base, non selezionare questa casella.NOTA: I parametri di adattamento possono essere corretti prima di eseguire un adattamento facendo clic sulla colonna dell’etichetta nella casella in basso a destra sotto i coefficienti di adattamento globali. L’etichetta diventerà rossa e cambierà per avere un indicatore (fisso) sull’etichetta. Qualsiasi valore digitato nella casella a destra verrà utilizzato per quel parametro anziché variato liberamente per l’adattamento. È necessario prestare attenzione quando si fissano i valori per un adattamento, in quanto ciò potrebbe influenzare i risultati dell’adattamento. Fare clic sul pulsante Adatta . L’avanzamento dell’adattamento verrà visualizzato tramite una piccola barra di caricamento al centro dello schermo. Al termine dell’avanzamento dell’adattamento, le finestre verranno popolate con i dati dell’adattamento (Figura 5 e Figura 14 supplementare). Esamina visivamente i risultati dell’adattamento.NOTA: Le informazioni provenienti sia dall’adattamento cinetico principale che dal DADS vengono utilizzate per determinare se vale la pena salvare l’adattamento o se è troppo scarso. Generalmente, se l’adattamento delle tracce principali corrisponde bene ai dati e non ci sono caratteristiche o ci sono pochissime caratteristiche nel grafico, l’adattamento può essere accettato. È facile controllare accoppiamenti multipli modificando il numero di durate e/o selezionando/deselezionando il pulsante “Usa offset (Ainf)”. Deve essere accettato il miglior adattamento prodotto dopo aver controllato più variazioni dei parametri di adattamento. Fare clic sul pulsante Salva . In questo modo verrà salvata l’idoneità attualmente mostrata insieme ai dati in un file Excel.NOTA: il file Excel viene salvato nella stessa posizione del set di dati. Se vengono eseguiti adattamenti aggiuntivi e devono essere salvati, sovrascriveranno qualsiasi versione precedente. Pertanto, prima di generare e salvare un nuovo adattamento, assegnare un nome univoco a qualsiasi adattamento precedente. I parametri salvati dall’adattamento includono solo lo zero temporale, l’IRF, le durate e i DADS associati. Questo file non contiene alcuna informazione sul grafico o sull’adattamento alle tracce cinetiche principali. Il salvataggio delle tracce cinetiche principali è descritto nel passaggio 3.3. Vedere il passaggio 3.0 per informazioni su come salvare i dati dalla finestra dei dati grezzi per la visualizzazione e la stampa successive. 3. Estrazione dei dati grezzi e degli adattamenti dal software di fitting per la stampa NOTA: I dati grezzi o gli accoppiamenti prodotti dall’adattamento di una singola lunghezza d’onda o dall’analisi globale possono essere esportati in file csv che possono essere aperti in una serie di altri programmi. Estrazione di dati grezzi per la creazione di graficiPer esportare la mappa termica del set di dati, fare clic sul menu File , quindi fare clic su Esporta in CSV (Figura supplementare 15). Si aprirà una finestra, fare clic su OK per salvare il file csv nella stessa directory del file di dati aperto con lo stesso nome del file di dati.NOTA: In alternativa, i dati grezzi possono essere esportati facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra della mappa termica e facendo clic su Esporta dati negli Appunti. In questo modo i dati verranno salvati temporaneamente in modo che possano essere incollati in un documento software a scelta dell’utente. Incolla i dati in un file Excel, quindi salva i dati. Più spettri possono essere visualizzati nella finestra per il confronto o allo scopo di creare una figura. Trascina il cursore orizzontale (nella mappa termica, in alto a sinistra) su un punto temporale desiderato. Premere Ctrl + S per selezionare lo spettro e salvarlo nella finestra spettrale (in basso a sinistra). Aggiungere tutti i punti temporali necessari per mostrare la progressione dei dati (5-10 spettri), come mostrato nella Figura 3.NOTA: Il numero di spettri scelti per rappresentare i dati e la disposizione temporale di questi spettri possono dipendere fortemente dal campione specifico e dalle condizioni sperimentali. La raccomandazione di cui sopra è una linea guida generale, ma le specifiche dell’esperimento dovrebbero dettare quali parti del set di dati vengono enfatizzate. Esportare come dati facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra contenente gli spettri. Fare clic sull’opzione Esporta dati negli Appunti . I dati vengono salvati temporaneamente. Incollare questi dati nel documento software desiderato (ad esempio, Excel) e salvare. Più tracce cinetiche possono essere visualizzate nella finestra cinetica allo stesso modo della finestra degli spettri. Trascina il cursore verticale (nella mappa termica, in alto a sinistra) sulla lunghezza d’onda desiderata. Premere Ctrl + X per selezionare la traccia temporale e salvarla nella finestra cinetica (in alto a destra). Aggiungi tutti i punti tempo che desideri. In questo modo la traccia cinetica corrente verrà salvata temporaneamente nella finestra. Esportare come dati facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra contenente le tracce cinetiche. Fare clic sull’opzione Esporta dati negli Appunti . I dati vengono salvati temporaneamente. Incollare questi dati nel documento software desiderato (ad esempio, Excel) e salvare. Estrazione dei dati da un raccordo a lunghezza d’onda singola per la visualizzazioneFare clic sul menu Cinetica , quindi fare clic su Adatta cinetica per aprire la finestra contenente i dati adattati. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra di adattamento (ad esempio, il riquadro centrale nella finestra di adattamento singolo). Fare clic su Esporta dati negli appunti. Questo lo salverà temporaneamente in modo che possa essere incollato in un altro programma software.NOTA: Il grafico residuo al di sotto dei dati di adattamento non può essere esportato e dovrà invece essere ricreato dai dati di adattamento. L’adattamento esporta sia i dati grezzi che la linea di adattamento, che possono quindi essere utilizzati per ricreare il residuo. Il residuo viene creato sottraendo il valore di adattamento dai dati in ogni punto temporale e creando un grafico simile a quello mostrato nella finestra “Cinetica di adattamento”. Incollare questi dati nel documento software desiderato (ad esempio, Excel) e salvare.NOTA: l’esportazione negli appunti includerà solo i dati grezzi e i dati della linea di adattamento per ogni esponenziale utilizzato nell’adattamento. I parametri dell’adattamento, come le durate, le ampiezze e così via, non verranno inclusi e dovranno essere esportati copiando i valori dal software di adattamento. Estrazione di dati dall’analisi del ciclo di vita globale per la visualizzazione e l’analisiFare clic sul menu Superficie , quindi fare clic sull’opzione Adattamento globale per aprire la finestra contenente i dati adattati. La precisione per i valori di entrambi gli assi densità ottica e ritardo/lunghezza d’onda dovrà essere regolata rispettivamente per i componenti principali (riquadro in alto a destra) e DADS (riquadro in basso a sinistra). Posizionare il mouse sulla finestra del componente principale fino a visualizzare la casella delle impostazioni in basso a destra. Fare clic rapidamente sul pulsante x.xx , passare il mouse su “Precisione” e fare clic su 6 dal menu per impostare il numero di cifre decimali da includere. Posizionare il mouse sulla finestra del componente principale fino a visualizzare la casella delle impostazioni in basso a destra. Fare clic rapidamente sul pulsante y.yy , passare il mouse su “Precisione” e fare clic su 6 dal menu per impostare il numero di cifre decimali da includere. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra Tracce cinetiche principali . Fare clic su Esporta dati negli appunti. Questo lo salverà temporaneamente in modo che possa essere incollato in un altro programma software. Incollare questi dati nel documento software desiderato (ad esempio, Excel) e salvare.NOTA: I dati verranno salvati come una serie di colonne contenenti prima i Ritardi Temporali, poi le Tracce Cinetiche Principali seguite dalla linea di adattamento. Ci sarà un insieme per ogni componente principale selezionato durante la preparazione per l’analisi globale. Gli spettri DADS sono già stati salvati come parte della procedura di fitting al punto 2.4.7.

Representative Results

La preparazione e l’analisi di un campione di 1,4-Bis[2-(5-feniloxazolil)]benzene, POPOP in etanolo sono state effettuate seguendo la procedura sopra descritta. Le misurazioni sono state effettuate utilizzando uno spettrometro ad assorbimento transitorio ultraveloce, come descritto nella Figura 1, con soluzioni fluide in cuvette da 2 mm utilizzando un supporto per cuvette regolabile e un agitatore magnetico per garantire la miscelazione. I campioni sono stati misurati in condizioni ambientali senza ulteriori controlli per la temperatura o l’atmosfera. La finestra ottica da 340 nm a 680 nm è stata generata utilizzando un cristallo di fluoruro di calcio. Duecentocinquanta (250) punti temporali sono stati raccolti tra -5 ps e ~5500 ps e sono state calcolate tre scansioni per generare il set di dati finale, Figura 3. I dati POPOP sono stati preparati come descritto nel protocollo. Un esempio di correzione del chirp sub-ottimale è mostrato nella Figura 16 supplementare. L’adattamento cinetico a singola lunghezza d’onda è stato eseguito su POPOP, selezionando 632 nm come lunghezza d’onda di interesse. Inoltre, è stata effettuata un’analisi globale su POPOP come descritto nel protocollo. L’adattamento cinetico a singola lunghezza d’onda di POPOP a 632 nm ha prodotto due vite. Queste durate sono state lasciate variare e non sono stati fatti ulteriori aggiustamenti. I parametri finali ottenuti sono stati i seguenti: t0 = −0,1176 ps, IRF = 0,436 ps, A1 = 0,0956, t1 = 1,614 ps, A2 = 0,0646, t2 = 522,2 ps (Figura 4). Questi risultati sono in buon accordo con l’analisi globale effettuata successivamente e con i valori di durata delle emissioni riportati per POPOP (τ = 1,35 ns)17. Un esempio di adattamento a lunghezza d’onda singola con un numero troppo basso di componenti di durata è mostrato e discusso nella Figura 16 supplementare. L’adattamento dell’analisi globale su POPOP è stato eseguito dopo aver selezionato 15 componenti principali (PC) durante l’esecuzione di SVD. Dopo l’adattamento sono state selezionate due durate, nessun parametro è stato fissato. I parametri finali ottenuti dal fitting sono stati i seguenti: t0 = −0.1586 ps, tp (IRF) = 0.4408 ps, t1 = 1459 ps, t2 = 267.5 ps. Gli spettri delle differenze associate al decadimento sono mostrati nella Figura 5. I risultati sono stati in buon accordo con quelli del singolo kinetic fitting a 632 nm e con i valori di durata per POPOP17. Due esempi di analisi globale sub-ottimale sono mostrati e discussi nella Figura 16 supplementare. Figura 1: Rappresentazione schematica dello strumento di assorbimento transitorio a banda larga a femtosecondi descritto in questo protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Simulazione dei dati TAS e dei contributi al segnale TAS. (A) Curve gaussiane che simulano uno spettro di assorbimento dello stato fondamentale (linea tratteggiata blu) e uno spettro dello stato eccitato (linea tratteggiata rossa, spostata verso il rosso rispetto allo spettro dello stato fondamentale). Gli spettri di differenza di questi due spettri (viola, linea continua) è lo spettro delle differenze come visto in TA. Le differenze tra gli spettri dello stato fondamentale e quelli eccitati sono state esagerate a scopo illustrativo. (B) Uno spettro rappresentativo delle differenze TA di POPOP a 1,04 ps dopo eccitazione a 330 nm. Le linee tratteggiate mostrano l’assorbanza allo stato fondamentale e l’emissione allo stato stazionario di POPOP. Le regioni evidenziate mostrano caratteristiche comuni di TA, sbiancamento allo stato fondamentale (GSB), emissione stimolata (SE) e assorbanza allo stato eccitato (ESA) osservate all’interno di questi dati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Dati preparati per POPOP risultanti dall’applicazione del passaggio 1 – Preparazione dei dati. I dati vengono mostrati come mappa di calore corretta e spettri rappresentativi. Questi risultati dimostrano come dovrebbero apparire i dati dopo che le correzioni sono state applicate e si è pronti per applicare un adattamento al set di dati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Risultati dell’adattamento a lunghezza d’onda singola di POPOP a 632 nm dopo l’applicazione della fase 2.3 – Adattamento a lunghezza d’onda singola. La figura mostra (sezione superiore) le durate ottenute in formato tabellare, (sezione centrale) i dati (punti blu) e l’adattamento ai dati (linea di adattamento rossa) e (sezione inferiore) il grafico residuo. Si noti che nella sezione “adattamento corrente”, le ampiezze (A) sono mostrate come valori ΔA dai dati che rappresentano il contributo di quella specifica componente della durata a t0. Tuttavia, quando l’adattamento corrente viene salvato e visualizzato nella tabella “Coefficienti di adattamento”, l’impostazione predefinita è quella di visualizzare le ampiezze normalizzate. Questa impostazione può essere modificata deselezionando la casella accanto all’etichetta “Coefficienti di adattamento” “Normalizzato”. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Risultati dell’analisi globale di adattamento di POPOP ottenuti dopo il passaggio 2.4 di adattamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Esempio di scattering Raman stimolato osservato in dati sperimentali di TA. In questo set di dati (non i dati POPOP mostrati nell’esercitazione), il campione è stato eccitato a 550 nm (indicato dalla linea tratteggiata). Lo scattering Raman si osserva intorno al tempo zero e generalmente appare sia al blu (scattering Raman anti-Stokes) che al rosso (scattering Raman di Stokes) della lunghezza d’onda di eccitazione della pompa. Lo scattering Raman stimolato è di breve durata, in genere solo intorno a ~200 fs, perché si verifica come risultato dell’interazione del fascio della sonda con il campione contemporaneamente al fascio della pompa, stimolando così il processo Raman. Tuttavia, la funzione non può essere evitata e deve essere rimossa con il ritaglio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 1 supplementare: Menu principale durante il caricamento iniziale dei dati. Generalmente, in questo software di adattamento ci saranno caselle di opzione che appaiono nell’angolo in basso a destra di una finestra quando la finestra viene spostata con il mouse. Queste caselle consentono di modificare l’interazione del cursore con la finestra, spostando le selezioni, ingrandendo o spostando le finestre selezionate. Sono inoltre disponibili opzioni per regolare la precisione delle scale dell’asse x e dell’asse y per la finestra, nonché per passare dalla visualizzazione lineare a quella logaritmica. Gli assi possono anche essere bloccati o sbloccati. Mentre è bloccato, un asse rimarrà al livello di zoom o all’intervallo di valori specificato; Una volta sbloccato, l’intervallo passerà a contenere l’intero set di dati. Altre opzioni consentono di regolare la visualizzazione dei numeri e la colorazione delle griglie, se presenti. Fare clic qui per scaricare il file. Figura 2 supplementare: Menu Superficie per eseguire la sottrazione di luce diffusa. Fare clic qui per scaricare il file. Figura 3 supplementare: Sottrai schermo a luce diffusa – impostazione degli spettri sulla media. Fare clic qui per scaricare il file. Figura 4 supplementare: Impostazione dell’intervallo di ritaglio. Fare clic qui per scaricare il file. Figura 5 supplementare: Set di dati di ritaglio. I dati ritagliati verranno rimossi in modo permanente. Fare clic qui per scaricare il file. Figura 6 supplementare: Finestra di risposta del solvente di adattamento ed esempio di adattamento della risposta del solvente (in linea rossa) ai dati (punti blu). Fare clic qui per scaricare il file. Figura 7 supplementare: Finestra di correzione del chirp con dati di esempio “vuoti”. Fare clic qui per scaricare il file. Figura 8 supplementare: Correzione del chirp mostrata insieme al set di dati. Fare clic qui per scaricare il file. Figura 9 supplementare: Finestra Single Kinetic Fit. Inoltre, un cursore nella parte superiore consente all’utente di selezionare la lunghezza d’onda alla quale eseguire l’adattamento. La selezione di una lunghezza d’onda appropriata richiede la conoscenza della spettroscopia del sistema per identificare dove si verificano i processi di interesse. Gli esempi includono i prodotti a trasferimento di carica, la formazione di triplette o la formazione di fotoprodotti, le cui caratteristiche spettrali sono note per essere correlate a lunghezze d’onda specifiche. Queste lunghezze d’onda specifiche possono essere adattate per ottenere la durata di quegli eventi specifici. Inoltre, è possibile utilizzare una selezione di lunghezze d’onda per fornire la convalida di un modello di adattamento globale selezionato. Fare clic qui per scaricare il file. Figura 10 supplementare: Impostazione dei parametri di adattamento cinetico singolo. I singoli parametri di adattamento possono essere fissati o modificati manualmente, se lo si desidera, per regolare con precisione l’adattamento e ridurre al minimo la deviazione standard del residuo. Nota: i parametri possono essere facilmente regolati facendo clic sul valore nella casella e quindi regolandoli utilizzando un cursore o digitando manualmente un valore. Il raccordo visualizzato verrà regolato in tempo reale man mano che i valori vengono modificati. Quando viene raggiunto un adattamento accettabile, l’adattamento può essere esportato facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla schermata di adattamento, che consente di esportare i dati negli appunti per incollarli in un programma desiderato o come immagine per una rapida visualizzazione. Fare clic qui per scaricare il file. Figura 11 supplementare: Vincolare e fissare i valori dei parametri Single Kinetic Fit può essere eseguito se uno o più parametri sono ben noti. Fare clic qui per scaricare il file. Figura 12 supplementare: finestra di scomposizione a valore singolo con componenti principali che mostra l’aspetto della traccia e dei componenti quando viene aggiunto un numero sufficiente di componenti principali. Fare clic qui per scaricare il file. Figura 13 supplementare: Finestra di adattamento globale prima della generazione dell’adattamento dell’analisi globale. Fare clic qui per scaricare il file. Figura 14 supplementare: finestra Global Fit che mostra i risultati dell’adattamento dell’analisi globale. Fare clic qui per scaricare il file. Figura supplementare 15: Menu File per il salvataggio e l’esportazione dei file. Fare clic qui per scaricare il file. Figura supplementare 16: Esempi di correzione e adattamento del chirp non ottimale. (A) dimostra uno scarso adattamento cinetico singolo. Il tipo di residuo strutturato mostrato nel pannello A indica in genere che è necessaria una durata aggiuntiva per adattare i dati. Si noti che il residuo scende al di sotto dello zero in tempi più brevi e viene sollevato al di sopra della linea dello zero a durate più lunghe. (B) mostra una corretta correzione del chirp utilizzando il pulsante di anteprima, in cui le caratteristiche vengono raddrizzate e non è presente alcuna curvatura nei dati. (C) dimostra una correzione chirp errata in cui è presente una notevole curvatura nella porzione blu dello spettro, indicando che la funzione chirp si sta correggendo eccessivamente in questa regione. (D) mostra uno scarso adattamento dell’analisi della durata globale in cui l’overfitting (inclusi troppi parametri) ha portato a DADS “simmetrici” (che sembrano immagini speculari l’uno dell’altro lungo l’asse x) di intervalli di vita simili che essenzialmente si annullano a vicenda. Quando si osservano queste caratteristiche, l’adattamento non deve essere utilizzato. (E) mostra uno scarso adattamento globale in cui troppi parametri hanno portato a una durata molto breve con un’ampiezza molto ampia. Il problema presente in (E) può anche apparire se gli artefatti intorno al tempo zero non vengono corretti correttamente e il raccordo si concentra sulla minimizzazione del residuo enfatizzando eccessivamente la durata molto breve (che non è fisicamente significativa). Fare clic qui per scaricare il file. Figura supplementare 17: Esempio di dati TAS con scattering Raman. Lo scattering è presente intorno al tempo zero e coincide con la lunghezza d’onda di eccitazione della pompa. Lo scattering consiste in una serie di picchi acuti con un picco positivo molto intenso blu dell’eccitazione della pompa e un picco negativo rosso dell’eccitazione della pompa. Questa funzione non può essere impedita in modo ragionevole e deve essere ritagliata dai dati per evitare di interferire con i risultati di adattamento. Fare clic qui per scaricare il file. File supplementare 1: file che contiene il set di dati per questa esercitazione (POPOP data_POPOP-inEtOH.ufs). Fare clic qui per scaricare il file. File supplementare 2: file che contiene un set di dati vuoto per questa esercitazione (POPOP data_BLANK.ufs). Fare clic qui per scaricare il file. File supplementare 3: File di informazioni di supporto contenenti ulteriori commenti sulla risposta del solvente di adattamento, sulla correzione per lo scatting e sulla sottrazione di superfici. Fare clic qui per scaricare il file.

Discussion

Considerazioni generali per la preparazione dei dati
L’adattamento dei dati TA può sembrare a prima vista relativamente semplice e ci si potrebbe aspettare che una “risposta” chiara e corretta dovrebbe risultare per un dato set di dati. Tuttavia, come evidenziato nel protocollo, ci sono molti fattori nell’acquisizione, nella preparazione dei dati e nell’analisi dei dati da considerare attentamente che possono portare a incertezza su quale modello o insieme di parametri di adattamento descrive meglio i dati. L’obiettivo della preparazione e dell’adattamento dei dati è quello di ridurre il maggior numero possibile di questi fattori estranei, preservando al contempo i dati per l’analisi. Il compito a portata di mano potrebbe sembrare scoraggiante per un principiante, poiché c’è molto da considerare. Per acquisire un’idea del processo di adattamento, il principiante è incoraggiato a provare a preparare gli stessi dati più volte da zero in modi leggermente diversi per verificare in che modo le fasi di preparazione dei dati influiscono notevolmente sull’adattamento migliore. Inoltre, due ricercatori diversi possono preparare e adattare gli stessi dati e confrontare i risultati. Questo processo può richiedere molto tempo le prime volte, tuttavia, ciò consentirà al principiante di sviluppare intuizioni su come preparare in modo coerente i dati per i campioni futuri. Come ogni abilità, la preparazione e l’adattamento dei dati richiederanno tempo per svilupparsi e il principiante è incoraggiato a essere paziente e disciplinato durante la sperimentazione e l’apprendimento del processo. Il set di dati utilizzato in questo studio viene fornito per dare al principiante la possibilità di adattarsi direttamente al tutorial e di confrontare direttamente i risultati con quelli prodotti nel tutorial.

I dati possono contenere caratteristiche di fondo che sono presenti in tutti i ritardi temporali (Figura 2 supplementare e Figura 3 supplementare) come la dispersione del fascio della pompa e l’emissione spontanea del campione. Queste caratteristiche indesiderate devono essere rimosse al fine di isolare il segnale di assorbimento transitorio dalla specie di interesse11. La rimozione di tali caratteristiche viene effettuata scegliendo, calcolando la media e rimuovendo il contributo di un certo numero di spettri di differenza temporale negativa. Quando si selezionano gli spettri di sfondo, è importante assicurarsi che non vengano incluse per la rimozione le caratteristiche che potrebbero far parte del processo di interesse. Nei dati di TA si possono osservare anche le caratteristiche di fondo derivanti dal solvente, come l’assorbimento da parte delle impurità o del solvente stesso. Quando il solvente produce un segnale, un set di dati “vuoto” contenente solo il solvente eseguito nelle stesse identiche condizioni sperimentali del campione dovrà essere sottratto dal set di dati del campione. I dettagli su questa procedura sono inclusi nel file supplementare 3.

La correzione del cinguettio è un altro fattore da considerare attentamente. Il chirp si verifica quando l’impulso della sonda viaggia verso il campione e si allarga a causa di imperfezioni negli specchietti dello sterzo o passando attraverso ottiche dispersive come lenti o filtri. Il risultato finale è che i fotoni a bassa energia nell’impulso della sonda (cioè il lato rosso dello spettro della sonda) arrivano al campione prima dei fotoni a energia più alta (cioè il lato blu dello spettro della sonda). Ciò si traduce nel “tempo zero” degli spettri TA che viene spalmato su diversi femtosecondi o picosecondi18, che si manifesta come una curva distinta nel set di dati grezzo che inizia nelle lunghezze d’onda blu e poi si appiattisce man mano che si avvicina al rosso (Figura 7 supplementare). Chirp è più evidente su scale temporali più brevi come quelle a cui si accede da TA ultraveloce. Questo tempo zero dipendente dalla lunghezza d’onda può essere corretto come descritto nel protocollo, ma l’applicazione di questo processo può essere complicata e soggettiva. Avere un campione “bianco” o una misurazione della risposta di Kerr del solvente può ridurre al minimo la natura soggettiva dei punti di prelievo manuale per la correzione del chirp necessaria per generare l’adattamento polinomiale utilizzato per regolare e correggere il chirp. L’obiettivo della correzione del cinguettio è quello di rimuovere la “curva” distinta del tempo zero. Potrebbero essere necessari più tentativi di adattamento del chirp per ottenere i migliori dati corretti dal chirp. I dati possono essere adattati più volte con diverse correzioni chirp applicate al fine di ottenere una comprensione dell’impatto che la correzione chirp ha sui valori delle brevi durate TA.

Artefatti che appaiono al “tempo zero”
Diversi artefatti possono essere osservati vicino al “tempo zero” nei dati TA, tra cui lo scattering di Rayleigh, lo scattering Raman stimolato e la modulazione di fase incrociata. Lo scattering di Rayleigh del fascio della pompa è uno scattering elastico che si verifica senza una variazione di energia. Questa funzione apparirà alla stessa lunghezza d’onda dell’impulso della pompa. Lo scattering Raman stimolato può accompagnare il segnale di scattering della pompa19. Lo scattering Raman, che deriva dalla dispersione anelastica di un fotone di pompa, produce picchi sia a energia più alta (anti-Stokes) che a energia più bassa (Stokes) rispetto all’energia della pompa incidente. Nei dati TA, si osserva lo scattering Raman stimolato a causa dell’irradiazione simultanea del campione con i fasci della pompa e della sonda. Quando il fascio della sonda interagisce con il campione contemporaneamente al fascio della pompa, stimola il processo Raman. Pertanto, lo scattering Raman stimolato si verifica intorno al tempo zero e si traduce in ulteriori picchi negli spettri entro le prime centinaia di femtosecondi (Figura 6, osservata nello spettro blu più scuro nella regione evidenziata e Figura 17 supplementare). La modulazione cross-phase ha origine dalla modulazione dell’indice di rifrazione del solvente dall’interazione con l’intenso campo elettrico di un impulso.

Lo scattering Raman stimolato può essere distinto dalla modulazione a fase incrociata perché i picchi Raman appaiono a frequenze specifiche che corrispondono ai modi vibrazionali del solvente. Poiché si tratta di un processo Raman, è possibile osservare sia le linee di Stokes che quelle anti-Stokes su entrambi i lati dell’eccitazione. I solventi clorurati come il cloruro di metilene mostrano bande Raman molto prominenti a causa della grande polarizzabilità del cloro. Le firme spettrali della modulazione di fase incrociata sono uniche per un solvente, ma non sono così facilmente prevedibili come le caratteristiche di scattering Raman.

A seconda della cinetica del campione misurato, lo scattering di Rayleigh, lo scattering Raman e la modulazione di fase incrociata possono sovrapporsi alle caratteristiche iniziali dei dati TA e possono essere difficili da rimuovere dai dati. In linea di principio, queste caratteristiche possono essere viste in una misurazione ordinata del solvente e sottratte dai dati, i programmi di analisi dei dati possono avere funzioni di adattamento per tenere conto di queste caratteristiche, ma in pratica questo può essere difficile. Quando è troppo difficile sottrarre questi artefatti senza compromettere i dati del campione, potrebbe essere meglio ritagliare gli spettri compromessi intorno al tempo zero per eliminare gli artefatti. In questo modo si avrà lo sfortunato effetto collaterale di rimuovere i primi circa 300 fs di dati, ma si renderà l’adattamento più affidabile in seguito. Nel corso dell’analisi di più set di dati dello stesso campione e di campioni diversi, il principiante acquisirà intuizione nel raggiungere questo equilibrio tra la sottrazione della superficie di sfondo e il ritaglio dei dati iniziali di 100-200 fs.

Il ritaglio generale può essere necessario per porzioni di spettri che contengono un basso rapporto segnale/rumore. L’instabilità del fascio della sonda in determinate regioni, la bassa intensità della luce della sonda, le concentrazioni del campione troppo elevate (bloccando così gran parte della sonda incidente), la bassa intensità della pompa e la sezione trasversale di assorbimento del campione sono i tipici colpevoli del basso rapporto segnale/rumore che possono rendere difficile l’adattamento dei dati. In questi casi, ritagliare il set di dati su entrambi i lati della finestra ottica per ottenere il livello desiderato di segnale-rumore può aiutare il processo di adattamento.

Un set di dati è pronto per l’analisi una volta che è stato sufficientemente ritagliato per rimuovere le sezioni povere del set di dati, il chirp corretto e gli spettri di sfondo sono stati mediati e sottratti. Questa procedura dovrebbe risultare in dati che contengano solo le parti più rilevanti per la fotofisica e la fotochimica di interesse. In effetti, è chiaro che c’è un certo grado di soggettività in questo processo. L’obiettivo nella preparazione dei dati è quello di trovare un equilibrio tra la rimozione degli artefatti in modo che non perturbino l’adattamento, ma non la rimozione così tanto da compromettere l’integrità del set di dati, ostacolandone così l’interpretazione. Trovare questo equilibrio richiede tempo ed esperienza per costruire l’intuizione di ciò che è un artefatto e ciò che è un dato. Adattare (e riadattare) lo stesso set di dati in più giorni diversi, o avere due ricercatori che adattano gli stessi dati, può essere un modo per ridurre al minimo l’errore umano e la soggettività della preparazione e dell’analisi dei dati.

Considerazioni generali per l’adattamento e l’interpretazione
Dopo che gli spettri TA grezzi sono stati elaborati, questi devono essere interpretati e modellati per estrarre informazioni sulle specie e sulle dinamiche presenti nel sistema di interesse. Questo processo può essere descritto come una procedura in tre fasi che include l’interpretazione spettrale iniziale, la modellazione/adattamento quantitativo e l’assegnazione dell’interpretazione spettrale al modello/adattamento.

Interpretazione spettrale iniziale: Nella fase di interpretazione spettrale, l’obiettivo è quello di assegnare le caratteristiche presenti negli spettri TA agli stati elettronici a cui si accede nell’evoluzione fotofisica o fotochimica del sistema. Per cominciare, è necessario identificare i vari stati. In questo lavoro, gli stati si riferiscono a stati elettronici unici che fanno parte dell’evoluzione fotofisica o fotochimica del sistema. Uno stato, rappresentato, ad esempio, da una specifica curva di energia potenziale (PEC), possiede un insieme di picchi caratteristici che rappresentano il suo spettro di assorbimento. Una modifica che si verifica all’interno di un singolo stato è chiamata processo. Un processo fotofisico può apparire negli spettri TA come uno spostamento di picco o un cambiamento nell’ampiezza dello spettro. L’aspetto chiave di un processo è che la popolazione dello stato rimane la stessa (cioè, il processo avviene all’interno di un dato PEC); È la distribuzione dell’energia all’interno dello stato che cambia. Un cambiamento nella popolazione di uno stato sarà indicato come transizione. Durante una transizione, il sistema evolve in un’altra PEC (cioè in stato elettronico). Le transizioni possono includere la conversione interna (IC), l’attraversamento intersistemico (ISC), il trasferimento di carica, il trasferimento di energia, la formazione di nuovi prodotti o il ritorno allo stato fondamentale. Le linee guida per l’assegnazione di stati, processi e transizioni sono illustrate nei paragrafi seguenti.

Assegnazione di stati
Il primo passo di questo processo prevede l’assegnazione di caratteristiche spettrali a specifiche specie o stati chimici. Lo stato S1 in TA dovrebbe mostrare un tempo di vita che corrisponda al tempo di vita della fluorescenza ottenuto utilizzando la spettroscopia di emissione risolta nel tempo. Uno stato di tripletta può essere verificato se la sua durata è spenta dall’ossigeno. Se si sospetta un anione o un catione radicale nell’evoluzione fotofisica, la spettroelettrochimica o l’ossidazione/riduzione chimica possono essere eseguite per generare la specie radicalica e uno spettro di assorbimento di tale specie può essere ottenuto e confrontato con la forma della banda TA. La spettroscopia di risonanza di spin elettronico (ESR) può essere eseguita per verificare la presenza di radicali liberi. Un eccellente discorso tutorial ospitato dalla Divisione di Chimica Inorganica dell’ACS fornisce una panoramica dell’AT e di tali considerazioni nell’assegnazione delle funzionalità20. Dopo che le bande sono state assegnate alle specie, il passo successivo nell’interpretazione degli spettri TA è quello di descrivere qualitativamente i processi dinamici che avvengono nel sistema. Questo passaggio è fondamentale in quanto dà al ricercatore un’idea di quali modelli saranno appropriati per descrivere il proprio sistema e fornirà loro una linea di base con cui confrontare i parametri di adattamento.

Modifiche all’interno di uno stato
Il raffreddamento vibrazionale, il riarrangiamento geometrico o la solvatazione sono processi estremamente rapidi (da sub-ps a 10 ps) che possono essere osservati con TA. Il raffreddamento vibrazionale è osservato come un rapido spostamento verso il blu dello spettro TA su una scala temporaledi diversi picosecondi 21,22,23. Il riarrangiamento geometrico può avvenire sulla scala temporale di 10 ps. Le dinamiche di solvatazione sono osservate come uno spostamento verso il rosso e un restringimento dello spettro su diversi picosecondi nei liquidi dipolari convenzionali, ma solventi ad alta viscosità come glicerolo, polietilenglicole (PEG), liquidi ionici e solventi eutettici profondi possono mostrare dinamiche di solvatazione che si verificano nel corso di più nanosecondi 24,25,26.

Cambiamenti nella popolazione di uno stato
Le reazioni sono caratterizzate da un cambiamento nell’intensità di una banda, dove una diminuzione dell’intensità è associata a una diminuzione della concentrazione della sua specie chimica e viceversa per un aumento. In alcuni casi, sia il reagente che la specie del prodotto sono visibili negli spettri, mentre in altri, gli stati del prodotto sono troppo di breve durata o troppo spostati verso il rosso per essere osservati. Spesso le transizioni da stato a stato possono essere osservate dalla presenza di un punto isosbestico negli spettri.

Modellazione quantitativa/adattamento: un modello deve quindi essere adattato ai dati per estrarre informazioni quantitative sulla dinamica del sistema. Come descritto in precedenza nell’introduzione, esiste una vasta gamma di modelli da utilizzare. Questo protocollo si concentra su due dei metodi più comuni: l’adattamento a una singola lunghezza d’onda e l’analisi globale. Il metodo a lunghezza d’onda singola consiste nell’adattare le singole tracce di lunghezza d’onda dagli spettri a una forma funzionale, tipicamente una somma di esponenziali:

Equation 2(2)

dove ΔA(t) è il segnale TA ad una lunghezza d’onda scelta, n è il numero di componenti esponenziali e aiè l’ampiezza della componente esponenziale, i, con costante di tempo τi. È possibile aggiungere diversi componenti fino a quando l’adattamento non riproduce i dati sperimentali. L’obiettivo di qualsiasi processo di fitting è quello di modellare i dati utilizzando durate sufficienti per riprodurre bene i dati, ma senza sovradimensionare i dati includendo troppi componenti. Di conseguenza, i parametri ponderati di bontà dell’adattamento, ad esempio Equation 4, vengono utilizzati per determinare quando i dati sono adatti alle incertezze sperimentali5.

Dopo che il decadimento è stato adattato in modo soddisfacente, i parametri del modello possono essere utilizzati per caratterizzare la dinamica del sistema. Le costanti di tempo risultanti possono quindi essere estratte e interpretate. Sfortunatamente, il gran numero di caratteristiche sovrapposte negli spettri TA significa che una singola lunghezza d’onda nello spettro può contenere dinamiche corrispondenti a specie diverse le cui firme spettrali si sovrappongono, il che significa che le costanti di tempo estratte da un singolo adattamento di lunghezza d’onda possono rappresentare un composito di più processi coincidenti. Inoltre, qualsiasi cambiamento nella forma della banda e nella posizione influenzerà anche le ampiezze e le costanti di tempo estratte dall’adattamento a lunghezza d’onda singola. Questi problemi possono essere aggirati in alcuni casi con un metodo di adattamento chiamato “analisi della forma delle bande”, in cui si determina o si assume una forma funzionale per le bande TA di ciascuna specie assorbente nel sistema. Queste forme vengono poi pesate in base ad ampiezze dipendenti dal tempo e sommate insieme per riprodurre lo spettro osservato. Questa procedura è comunemente usata nell’analisi degli spettri di fluorescenza risolti nel tempo, ma le forme più complicate e le componenti sovrapposte delle bande TA rendono questo metodo sostenibile solo in pochi semplici casi, come dettagliato altrove10.

Un altro svantaggio dell’adattamento a singola lunghezza d’onda è che non sfrutta intrinsecamente l’ampia gamma spettrale offerta dai moderni esperimenti TA. Si potrebbe, in linea di principio, adattare metodicamente ogni singola lunghezza d’onda degli spettri, ma tale analisi è ingombrante, dispendiosa in termini di tempo e computazionalmente costosa. Per combattere questa sfida, è possibile utilizzare un metodo chiamato “analisi globale” per adattare simultaneamente un intero set di spettri TA a un insieme di parametri dinamici condivisi4. L’analisi globale e un metodo strettamente correlato chiamato analisi del bersaglio sono metodi di successo e ampiamente utilizzati, ma presentano anche una serie unica di inconvenienti e limitazioni. Come per qualsiasi modello, è imperativo comprendere i presupposti utilizzati per crearlo e le limitazioni che presentano.

Nell’analisi globale, gli spettri TA sono rappresentati da una matrice m per n, dove m rappresenta il numero di lunghezze d’onda misurate in ogni spettro e n rappresenta il numero di punti temporali raccolti. Si assume quindi che questa matrice sia scomponibile nel prodotto di altre due matrici:

Equation 3(3)

dove C(t) è una matrice n per k e S(λ) è una matrice m per k. Il valore k rappresenta il numero di componenti spettrali distinte utilizzate per riprodurre gli spettri. Ognuno di questi componenti rappresenta una specie assorbente con una firma spettrale e una dinamica uniche. La matrice S(λ) rappresenta gli spettri TA delle componenti k e C(t) le loro concentrazioni dipendenti dal tempo. Nell’implementazione più semplice e comune dell’analisi globale, si assume che ogni componente abbia una cinetica esponenziale singola (i = 1 nell’equazione 2, con ogni componente assegnato alla propria costante di tempo). In sintesi, l’intero spettro TA può essere rappresentato dalla somma delle componenti degli spettri k, ognuna con il proprio spettro di assorbimento caratteristico e il singolo decadimento esponenziale.

Quando gli spettri TA sono adattati, l’utente indovina quante componenti (cioè un valore per k) sono necessarie e fa un’ipotesi sulla costante di tempo associata a un decadimento singolo esponenziale di quelle specie. L’installatore genera quindi Cguess(t) e risolve l’equazione 3 per Sfit(t). Successivamente, Sfit(λ) e Cguess(t) vengono moltiplicati come nell’equazione 3 per creare gli spettri adattati, ΔA(λ,t)fit. Infine, i residui, ΔA(λ,t)exp − A(λ,t)fit, sono minimizzati e vengono restituitil’adattamento S(λ) ottimale e le costanti di tempo. La relativa semplicità dell’analisi globale, che rappresenta un intero insieme di spettri utilizzando una manciata di costanti di tempo e componenti spettrali fisse, la rende un metodo attraente (e di successo) per districare le complicate forme di banda e le dinamiche incontrate nella spettroscopia TA. Tuttavia, è necessario prestare attenzione per garantire che l’analisi globale sia un modello appropriato per il sistema in questione.

Un’ipotesi chiave nell’analisi globale, illustrata nell’equazione 3, è la completa separabilità delle porzioni di lunghezza d’onda e tempo della dinamica, una proprietà chiamata “bilinearità”. Questa ipotesi richiede che le forme delle bande componenti siano indipendenti dal tempo (cioè, hanno una forma spettrale fissa che non varia o si sposta nel tempo). L’unica cosa che cambia durante l’esperimento sono le popolazioni relative di ciascun componente, rappresentate da C(t). Su scale temporali lunghe, ~1 ns o giù di lì, questa ipotesi è in genere valida e l’analisi globale può essere utilizzata senza troppe preoccupazioni. D’altra parte, i processi di stato eccitato come il raffreddamento vibrazionale e la dinamica di solvatazione, prominenti sulle scale temporali ultraveloci accessibili da TA a femtosecondi, provocano cambiamenti dipendenti dal tempo nella firma spettrale di una specie e una rottura della bilinearità. Ciò non significa che l’analisi globale non possa riprodurre un set di dati, anzi, può sempre produrre un adattamento soddisfacente a condizione che venga utilizzato un numero sufficiente di componenti. Il problema sta quindi nell’interpretare gli spettri dei componenti e nell’assegnare le costanti di tempo a particolari processi di stato eccitato, poiché i componenti potrebbero non corrispondere più a specie assorbenti distinte. Pertanto, è necessario prestare sempre attenzione quando si applica l’analisi globale a situazioni in cui non è possibile assumere la bilinearità.

Assegnazione dell’interpretazione spettrale al modello/adattamento: una volta ottenuto un adattamento, l’interpretazione spettrale deve essere mappata sulle durate ottenute nell’adattamento. Le durate dell’adattamento sono assegnate sia ai processi che alle reazioni che sono state identificate nell’interpretazione iniziale degli spettri. Tuttavia, la valutazione iniziale degli spettri e il numero di durate adattate ottenute dal modello potrebbero non essere immediatamente mappate l’una sull’altra. In questa (comune!) situazione, l’installatore deve tornare indietro e valutare l’interpretazione iniziale. Forse c’è stato un raffreddamento vibrazionale o un altro processo che è stato perso nella valutazione iniziale, ma è stato identificato nel processo di modellazione e adattamento. Oppure, forse due diversi set di parametri di adattamento potrebbero riprodurre bene i dati e l’interpretazione iniziale può guidare quale set di parametri di adattamento viene scelto. In questa fase finale, l’installatore deve andare avanti e indietro tra l’interpretazione e l’adattamento per trovare una descrizione che porti a un’assegnazione fotofisica plausibile delle specie e delle dinamiche del sistema. È inoltre possibile esplorare altri programmi di fitting che includono modelli di fitting sequenziali, come l’analisi target, per integrare gli accoppiamenti prodotti dall’analisi globale e dal software di fitting presentato in questo articolo4.

In sintesi, questo protocollo discute la preparazione e l’adattamento dei dati di assorbimento transitorio. Il suo obiettivo è quello di evidenziare le sfide associate al processo e di commentare i modi per evitarle o attenuarle in modo pratico. L’adattamento dei dati TA, come l’adattamento della maggior parte dei dati incontrati nei campi tecnici, può essere complicato e, a volte, soggettivo. Pertanto, è fondamentale essere consapevoli del processo e dei limiti dei dati, della preparazione dei dati e degli strumenti matematici utilizzati per modellare e assegnare significato ai dati. Gli scienziati devono affrontare i dati e la modellazione con occhio critico.

Si può tentare di mitigare la soggettività dei loro attacchi. Ad esempio, i dati possono essere preparati e adattati da diversi punti di partenza e in giorni diversi per garantire che venga prodotto lo stesso adattamento. È possibile confrontare i dati rilevati in giorni diversi con una diversa preparazione del campione. Più ricercatori possono inserire gli stessi dati e confrontare i loro risultati. Nel corso del tempo, i ricercatori possono costruire un’intuizione sui dati che ottengono (in base alle specifiche della loro configurazione sperimentale e ai parametri sperimentali) che consentirà loro di essere più sicuri dei loro adattamenti.

C’è molto da imparare sull’adattamento dei dati TA e sui dettagli dei modelli discussi in questo articolo. Si consigliano con entusiasmo diversi eccellenti articoli di recensione che approfondiscono questo argomento 4,10,27. Questo protocollo è pensato per essere un ingresso per principianti nel processo di analisi e adattamento che stimola l’interesse per una comprensione più profonda del processo.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato reso possibile grazie al programma NSF Major Research Instrumentation che ha istituito la struttura laser multiutente per l’assorbimento transitorio (CHE-1428633). Questo materiale si basa sul lavoro sostenuto dalla National Science Foundation nell’ambito della sovvenzione n. CHE-2313290.

Materials

EtOH 200% Proof Decon Laboratories Inc CAS 64-17-5 Solvent used to prepare Sample
Helios transient absorption spectrometer  Ultrafast systems  https://ultrafast.systems/products/spectrometers-accessories/helios/ Transient absorption spectrometer
POPOP  1,4-Bis[2-(5-phenyloxazolyl)]benzene Tokyo Chemical Industry CAS 1806-34-4 Sample used for Examples
Surface Xplorer Ultrafast systems https://ultrafast.systems/products/spectrometers-accessories/surface-xplorer/ Fitting program

References

  1. Turro, N. J. . Modern Molecular Photochemistry. , (1991).
  2. Berera, R., van Grondelle, R., Kennis, J. T. M. Ultrafast transient absorption spectroscopy: Principles and application to photosynthetic systems. Photosynth Res. 101, 105-118 (2009).
  3. Ruckebusch, C., Sliwa, M., Pernot, P., de Juan, A., Tauler, R. Comprehensive data analysis of femtosecond transient absorption spectra: A review. J Photochem Photobiol C Photochem Rev. 13 (1), 1-27 (2012).
  4. Van Stokkum, I. H. M., Larsen, D. S., Van Grondelle, R. Global and target analysis of time-resolved spectra. Biochim Biophys Acta – Bioenerg. 1657 (2-3), 82-104 (2004).
  5. Megerle, U., Pugliesi, I., Schriever, C., Sailer, C. F., Riedle, E. Sub-50 fs broadband absorption spectroscopy with tunable excitation: putting the analysis of ultrafast molecular dynamics on solid ground. Appl Phys B Lasers Opt. 96 (2-3), 215-231 (2009).
  6. Kovalenko, S. A., Dobryakov, A. L., Ruthmann, J., Ernsting, N. P. Femtosecond spectroscopy of condensed phases with chirped supercontinuum probing. Phys Rev A – At Mol Opt Phys. 59 (3), 2369-2384 (1999).
  7. Villa, A., et al. Broadly tunable mid-infrared femtosecond pulses directly generated by an optical parametric amplifier. OSA Contin. 4 (11), 2837-2844 (2021).
  8. Brodeur, A., Chin, S. L. Ultrafast white-light continuum generation and self-focusing in transparent condensed media. J Opt Soc Am B. 16 (4), 637650 (1999).
  9. Lang, B. Photometrics of ultrafast and fast broadband electronic transient absorption spectroscopy: State of the art. Rev Sci Instrum. 89 (9), 093112 (2018).
  10. Beckwith, J. S., Rumble, C. A., Vauthey, E. Data analysis in transient electronic spectroscopy – an experimentalist’s. Int Rev Phys Chem. 39 (2), 135-216 (2020).
  11. Devos, O., Mouton, N., Sliwa, M., Ruckebusch, C. Baseline correction methods to deal with artifacts in femtosecond transient absorption spectroscopy. Anal Chim Acta. 705 (1-2), 64-71 (2011).
  12. . Surface Xplorer from Ultrafastsystems Available from: https://ultrafast.systems/products/spectrometers-a (2023)
  13. Gampp, H., Maeder, M., Meyer, C. J., Zuberbuhler, A. D. Calculation of equilibrium constants from multiwavelngth spectroscopic data-i mathematical considerations. Talanta. 32 (2), 95-101 (1985).
  14. Snellenburg, J. J., Laptenok, S., Seger, R., Mullen, K. M., van Stokkum, I. H. M. Glotaran: A Java-based graphical user interface for the R package TIMP. J Stat Softw. 49 (3), 1-22 (2012).
  15. . Python scripts to convert to and from comma separated values (.csv) and Ultrafast Systems binary data (.ufs) file formats Available from: https://bitbucket.org/ptapping/csv2ufs/src/master/ (2023)
  16. . Surface Xplorer manual Available from: https://ultrafastsystems.com/download/surface-xplorer/SurfaceXplorerManual.pdf (2023)
  17. Lakowicz, J. R. . Principles of fluorescence spectroscopy, 3rd Ed. , 883-886 (2006).
  18. Maciejewski, A., et al. Transient absorption experimental set-up with femtosecond time resolution. Femto- and picosecond study of DCM molecule in cyclohexane and methanol solution. J Mol Struct. 555 (1-3), 1-13 (2000).
  19. Lorenc, M., et al. Artifacts in femtosecond transient absorption spectroscopy. Appl. Phys. B Lasers Opt. 74, 19-27 (2002).
  20. . Transient absorption spectroscopy Available from: https://mediaspace.unm.edu/media/Physical+Inorganic+Tutorials+Transient+Absorption+Specctrscopy/1_t5pdqzgx (2023)
  21. Maçôas, E. M. S., Mustalahti, S., Myllyperkiö, P., Kunttu, H., Pettersson, M. Role of vibrational dynamics in electronic relaxation of Cr(acac)3. J Phys Chem A. 119 (11), 2727-2734 (2015).
  22. Brown, A. M., et al. Vibrational relaxation and redistribution dynamics in Ruthenium(II) polypyridyl-based charge-transfer excited states: a combined ultrafast electronic and infrared absorption study. J Phys Chem A. 122 (40), 7941-7953 (2018).
  23. Vlček, A., Kvapilová, H., Towrie, M., Záliš, S. Electron-transfer acceleration investigated by time resolved infrared spectroscopy. Acc Chem Res. 48 (3), 868-876 (2015).
  24. Horng, M. L., Gardecki, J. A., Papazyan, A., Maroncelli, M. Subpicosecond measurements of polar solvation dynamics: Coumarin 153 revisited. J. Phys. Chem. 99 (48), 17311-17337 (1995).
  25. LaRocca, M. M., Baker, G. A., Heitz, M. P. Assessing rotation and solvation dynamics in ethaline deep eutectic solvent and its solutions with methanol. J Chem Phys. 155 (3), 034505 (2021).
  26. Zhang, X. X., Liang, M., Ernsting, N. P., Maroncelli, M. Complete solvation response of coumarin 153 in ionic liquids. J Phys Chem B. 117 (16), 4291-4304 (2013).
  27. Jollife, I. T., Cadima, J. Principal component analysis: A review and recent developments. Philos Trans R Soc. A. 374 (2065), 20150202 (2016).

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Hamburger, R., Rumble, C., Young, E. R. An Introduction to Processing, Fitting, and Interpreting Transient Absorption Data. J. Vis. Exp. (204), e65519, doi:10.3791/65519 (2024).

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