Summary

Adjuvante Aktivität von Mycobacterium paratuberculosis bei der Verbesserung der Immunogenität von Autoantigenen während der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Published: May 12, 2023
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Summary

In dieser Arbeit stellen wir ein alternatives Protokoll vor, um eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in C57BL/6-Mäusen aktiv zu induzieren, indem wir das immunogene Epitop Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG)35-55 verwenden, das in einem unvollständigen Freund-Adjuvans suspendiert ist, das die hitzeabgetötete Mycobacterium avium-Subspezies paratuberculosis enthält.

Abstract

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE), die durch Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) induziert wird, erfordert eine Immunisierung durch ein MOG-Peptid, das in vollständigem Freund-Adjuvans (CFA) mit inaktiviertem Mycobacterium tuberculosis emulgiert ist. Die antigenen Bestandteile des Mykobakteriums aktivieren dendritische Zellen, um T-Zellen zur Produktion von Zytokinen anzuregen, die die Th1-Antwort über Toll-like-Rezeptoren fördern. Daher stehen die Menge und Art der Mykobakterien, die während der antigenen Herausforderung vorhanden sind, in direktem Zusammenhang mit der Entwicklung von EAE. In dieser Arbeit wird ein alternatives Protokoll zur Induktion von EAE in C57BL/6-Mäusen unter Verwendung eines modifizierten unvollständigen Freund-Adjuvans vorgestellt, das den hitzeabgetöteten Mycobacterium avium-Subspezies Paratuberculosis-Stamm K-10 enthält.

M. paratuberculosis, ein Mitglied des Mycobacterium avium-Komplexes, ist der Erreger der Johne-Krankheit bei Wiederkäuern und wurde als Risikofaktor für mehrere menschliche T-Zell-vermittelte Erkrankungen, einschließlich Multipler Sklerose, identifiziert. Insgesamt zeigten Mäuse, die mit Mycobacterium paratuberculosis immunisiert wurden, einen früheren Krankheitsbeginn und einen höheren Schweregrad der Erkrankung als Mäuse, die mit CFA immunisiert wurden, die den Stamm von M. tuberculosis H37Ra in der gleichen Dosis von 4 mg/ml enthielt. Die antigenen Determinanten des Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) Stammes K-10 waren in der Lage, während der Effektorphase eine starke Th1-Zellantwort zu induzieren, die durch eine signifikant höhere Anzahl von T-Lymphozyten (CD4+, CD27+), dendritischen Zellen (CD11c+, I-A/I-E+) und Monozyten (CD11b+, CD115+) gekennzeichnet war) in der Milz im Vergleich zu Mäusen, die mit CFA immunisiert wurden. Darüber hinaus schien die proliferative T-Zell-Antwort auf das MOG-Peptid in M. paratuberculosis-immunisierten Mäusen am höchsten zu sein. Die Verwendung eines Enzephalitogens (z. B. MOG35-55), das in einem Adjuvans emulgiert ist, das M. paratuberculosis in der Formulierung enthält, kann eine alternative und validierte Methode sein, um dendritische Zellen für das Priming von Myelinepitop-spezifischen CD4+ T-Zellen während der Induktionsphase von EAE zu aktivieren.

Introduction

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein gängiges Modell für die Untersuchung menschlicher demyelinisierender Erkrankungen1. Es gibt verschiedene Modelle der EAE: die aktive Immunisierung mit verschiedenen Myelinpeptiden in Kombination mit potenten Adjuvantien, die passive Immunisierung durch In-vitro-Transfer von myelinspezifischen CD4+ -Lymphozyten und transgene Modelle der spontanen EAE2. Jedes dieser Modelle verfügt über spezifische Merkmale, die es ermöglichen, verschiedene Aspekte der EAE zu untersuchen, wie z. B. den Beginn, die Effektorphase oder die chronische Phase. Das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein-Modell (MOG) der EAE ist ein gutes Modell, um die immunvermittelten Mechanismen der chronischen Neuroinflammation und Demyelinisierung zu untersuchen, da es durch mononukleäre entzündliche Infiltration, Demyelinisierung in der peripheren weißen Substanz und reduzierte Erholung nach dem Krankheitshöhepunktgekennzeichnet ist 1.

MOG-EAE wird durch Immunisierung empfänglicher Mäuse mit dem Peptid MOG35-55 im vollständigen Freund’schen Adjuvans (CFA) induziert, gefolgt von einer intraperitonealen Injektion von Pertussis-Toxin. Dadurch erhöht sich die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke und Myelin-spezifische T-Zellen, die in der Peripherie aktiviert werden, gelangen ins zentrale Nervensystem (ZNS), wo sie reaktiviert werden3. CFA spielt eine Schlüsselrolle bei der Induktion von EAE, indem es die Antigenaufnahme durch antigenpräsentierende Zellen und die Expression von Zytokinen im Zusammenhang mit humoralen und zellvermittelten Reaktionen erhöht4. Dieser Mechanismus ist hauptsächlich auf das Vorhandensein von abgetötetem Mycobacterium tuberculosis zurückzuführen, das in Öl emulgiert ist und dessen Bestandteile einen starken Reiz für das Immunsystem darstellen5. Tatsächlich steht die Induktion von EAE in direktem Zusammenhang mit der Menge an Mykobakterien, die während der Antigen-Provokation vorhanden ist6.

Die Zugabe anderer abgetöteter Mykobakterien, wie z.B. Mycobacterium butyricum, zu unvollständigem Freund-Adjuvans7 sowie die Wirkung von Adjuvanskombinationen8 können den klinischen Verlauf der EAE modulieren und somit die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse beeinflussen. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), der ätiologische Erreger der Johne-Krankheit bei Wiederkäuern, wurde mit entzündlichen Erkrankungen des menschlichen ZNS in Verbindung gebracht 9, da seine antigenen Komponenten in der Lage sind, bei Patienten mit Multipler Sklerose und Neuromyelitis-optica-Spektrum-Störungeine starke humorale und zellvermittelte Reaktion hervorzurufen9. Daher zeigen wir in diesem Protokoll eine alternative und reproduzierbare Methode zur Induktion von MOG-EAE, indem M. tuberculosis in CFA durch M. paratuberculosis ersetzt wird.

Protocol

Alle Mausversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Juntendo University School of Medicine genehmigt (Zulassungsnummer 290238) und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health für Tierversuche durchgeführt. 1. Allgemeine Bemerkungen zum Experiment Die Mäuse werden in Einzelkäfigen in der Tierhaltung unter kontrollierten, erregerfreien Bedingungen bei 23 °C ± 2 °C mit 50 % ± 10 % Luftfeuchtigkeit und einem …

Representative Results

Gruppen von C57BL/6-Mäusen (gesamt n = 15/Gruppe) wurden mit MOG35-55 in einer M. paratuberculosis-haltigen Emulsion oder mit der üblichen Methode mit CFA immunisiert. Alle Gruppen von Mäusen zeigten eine akute monophasische Erkrankung, die durch einen einzigen Höhepunkt der Behinderung nach 14-17 Tagen gekennzeichnet war, gefolgt von einer teilweisen Erholung der Symptome in den nächsten 10 Tagen (Abbildung 1A). Mäuse, die mit dem M…

Discussion

Wir demonstrierten ein robustes alternatives Protokoll zur aktiven Induktion schwerer EAE in C57BL/6J-Mäusen unter Verwendung des Peptids MOG35-55 , das in einem Adjuvans mit M. paratuberculosis10 emulgiert wurde. Die Induktion von EAE durch diese Methode führte zu einer schwereren Erkrankung als diejenige, die durch das gemeinsame Protokoll mit CFA induziert wurde. Dieser Unterschied könnte auf die unterschiedlichen Lipidkomponenten in der Zellwand der Mykobakterien zurück…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Japanischen Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaft unterstützt (Förder-Nr. JP 23K14675).

Materials

anti-mouse CD115 antibody Biolegend, USA 135505 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11b antibody Biolegend, USA 101215 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11c antibody Biolegend, USA 117313 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD16/32  antibody Biolegend, USA 101302 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD4  antibody Biolegend, USA 116004 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD8a  antibody Biolegend, USA 100753 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse I-A/I-E antibody Biolegend, USA 107635 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse Ly-6C  antibody Biolegend, USA 128023 for cytofluorimetry 1:1,000
BBL Middlebrook OADC Enrichment Thermo Fisher Scientific, USA BD 211886 for isolation and cultivation of mycobacteria
C57BL/6J mice Charles River Laboratory, Japan 3 weeks old, male and female
FBS 10279-106 Gibco Life Techologies, USA 42F9155K for cell culture, warm at 37 °C before use
Freeze Dryer machine Eyela, Tokyo, Japan FDU-1200 for bacteria lyophilization
incomplete e Freund’s adjuvant Difco Laboratories, MD, USA 263810 for use in adjuvant
Middlebrook 7H9 Broth Difco Laboratories, MD, USA 90003-876 help in the growth of Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 ATCC, USA BAA-968 bacteria from bovine origin
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated BD Biosciences, USA 743-26880-EA for use in adjuvant
Mycobactin J Allied Laboratory, MO, USA growth promoter
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 AnaSpec, USA AS-60130-10 encephalotigenic peptide
Ovalbumin (257-264) Sigma-Aldrich, USA S7951-1MG negative control antigen  for proliferative assay
pertussis toxin solution Fujifilm Wako, Osaka Japan 168-22471 From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability
Polytron homogenizer PT 3100 Kinematica for mixing the antigen with the adjuvant
RPMI 1640 with L-glutamine Gibco Life Techologies, USA 11875093 For cell culture
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi PerkinElmer, Waltham, MA, USA NET027W001MC for proliferation assay, use (1 μCi/well)
Zombie NIR Fixable Viability Kit Biolegend, USA 423105  cytofluorimetry, for cell viability

References

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Cossu, D., Tomizawa, Y., Momotani, E., Yokoyama, K., Hattori, N. Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (195), e65422, doi:10.3791/65422 (2023).

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