מערכת זילוח כבד נורמותרמית ex vivo (NEVLP) נוצרה עבור כבדי עכברים. מערכת זו דורשת ניסיון במיקרו-כירורגיה אך מאפשרת תוצאות זילוח הניתנות לשחזור. היכולת להשתמש בכבדים של עכברים מאפשרת לחקור מסלולים מולקולריים לזיהוי תוספי פרבוסט חדשים ומאפשרת ביצוע ניסויים המתמקדים בתיקון איברים.
פרוטוקול זה מציג מערכת NEVLP אופטימלית ללא אריתרוציטים באמצעות כבדי עכבר. שימור Ex vivo של כבדי עכברים הושג על ידי שימוש בצינוריות וטכניקות מותאמות מציוד זילוח מסחרי קונבנציונלי. המערכת שימשה להערכת תוצאות השימור לאחר 12 שעות של זילוח. עכברי C57BL/6J שימשו כתורמי כבד, והכבדים הושתלו על ידי קנולציה של וריד הפורטל (PV) וצינור המרה (BD), ולאחר מכן שטיפת האיבר במי מלח חמים (37 מעלות צלזיוס). לאחר מכן, הכבדים שהושתלו הועברו לתא הזילוח והיו נתונים לזילוח מכונה מחומצנת נורמותרמית (NEVLP). דגימות פרפוזט כניסה ויציאה נאספו במרווחים של 3 שעות לצורך ניתוח פרפוזאט. עם השלמת הזלוף, דגימות כבד התקבלו לניתוח היסטולוגי, עם שלמות מורפולוגית שהוערכה באמצעות Suzuki-Score שונה באמצעות צביעת Hematoxylin-Eosin (HE). ניסויי האופטימיזציה הניבו את הממצאים הבאים: (1) עכברים במשקל של מעל 30 גרם נחשבו מתאימים יותר לניסוי בשל גודלו הגדול יותר של צינור המרה שלהם (BD). (2) צינורית פוליאוריתן 2 Fr (קוטר חיצוני = 0.66 מ”מ) התאימה יותר לקנולציה של הווריד הפורטלי (PV) בהשוואה לצינורית פוליפרופילן. זה יוחס לאחיזה המשופרת של חומר הפוליאוריתן, וכתוצאה מכך החלקת קטטר מופחתת במהלך המעבר מהגוף לתא האיבר. (3) עבור קנולציה של צינור המרה (BD), צינורית פוליאוריתן 1 Fr (קוטר חיצוני = 0.33 מ”מ) נמצאה יעילה יותר בהשוואה לצינורית פוליפרופילן UT – 03 (קוטר חיצוני = 0.30 מ”מ). בעזרת פרוטוקול אופטימלי זה, כבדי עכברים נשמרו בהצלחה למשך 12 שעות ללא השפעה משמעותית על המבנה ההיסטולוגי. צביעת Hematoxylin-Eosin (HE) חשפה ארכיטקטורה מורפולוגית שמורה היטב של הכבד, המאופיינת בעיקר hepatocytes קיימא עם גרעינים גלויים בבירור התרחבות קלה של סינוסיואידים בכבד.
השתלת כבד מייצגת את תקן הזהב לטיפול באנשים עם מחלת כבד סופנית. למרבה הצער, הביקוש לתרומת איברים עולה על ההיצע הזמין, מה שמוביל למחסור משמעותי. בשנת 2021 היו ברשימת ההמתנה להשתלת כבד כ-24,936 חולים, בעוד שרק 9,234 השתלות בוצעו בהצלחה1. הפער המשמעותי בין ההיצע והביקוש של שתלי כבד מדגיש את הצורך הדחוף לחקור אסטרטגיות חלופיות להרחבת מאגר התורמים ולשיפור הנגישות של שתלי כבד. אחת הדרכים להרחיב את מאגר התורמים היא להשתמש בתורמים שוליים2. תורמים שוליים כוללים אלה עם גיל מתקדם, סטאטוזיס בינוני או חמור. למרות שהשתלת איברים שוליים עשויה להניב תוצאות חיוביות, התוצאות הכלליות נותרות לא אופטימליות. כתוצאה מכך, פיתוח אסטרטגיות טיפוליות שמטרתן לשפר את תפקודם של תורמים שוליים נמצא כיום בעיצומו 3,4.
אחת האסטרטגיות היא להשתמש בזילוח מכונה, במיוחד זילוח מכונה מחומצן נורמתרמי, כדי לשפר את תפקודם של איברים שוליים אלה5. עם זאת, עדיין קיימת הבנה מוגבלת של המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההשפעות המועילות של זילוח מכונה מחומצנת נורמותרמית (NEVLP). עכברים, עם הזמינות השופעת שלהם של זנים מהונדסים גנטית, משמשים מודלים רבי ערך לחקר מסלולים מולקולריים. לדוגמה, המשמעות של מסלולי אוטופגיה בהקלה על פגיעה באיסכמיה בכבד הוכרה יותר ויותר 6,7. מסלול מולקולרי חשוב אחד בפגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה בכבד הוא מסלול miR-20b-5p/ATG78. נכון לעכשיו, קיימים מספר זני עכבר מסוג ATG knockout ו-knock-out מותנה, אך אין זני חולדות מתאימים9.
בהתבסס על רקע זה, המטרה הייתה ליצור פלטפורמת NEVLP ממוזערת עבור שתלי כבד עכבר. פלטפורמה זו תקל על חקירה והערכה של אסטרטגיות פוטנציאליות מהונדסות-גנטית שמטרתן לשפר את הפונקציונליות של הכבד של התורם. בנוסף, היה חיוני שהמערכת תתאים לזילוח לטווח ארוך, ותאפשר טיפול ex vivo בכבד, המכונה בדרך כלל “תיקון איברים”.
בהתחשב בזמינות המוגבלת של נתונים רלוונטיים במבחנה על זילוח כבד עכברים, סקירת הספרות התמקדה במחקרים שנערכו בחולדות. חיפוש שיטתי בספרות שנמשכה בין השנים 2010 ל-2022 בוצע באמצעות מילות מפתח כגון “זילוח כבד נורמתרמי”, “ex vivo or in vitro” ו”חולדות“. חיפוש זה נועד לזהות תנאים אופטימליים במכרסמים, ולאפשר לנו לקבוע את הגישה המתאימה ביותר.
מערכת הזילוח מורכבת ממאגר חיץ זכוכית אטום עם מעטפת מים, משאבת גלילים פריסטלטית, מחמצן, מלכודת בועות, מחליף חום, תא איבר ומערכת צינורות אופניים סגורה (איור 1). המערכת מבטיחה תחזוקה מדויקת של טמפרטורת זילוח קבועה של 37°C באמצעות מכונה תרמו-סטטית ייעודית. משאבת הגלילה הפריסטלטית מניעה את זרימת הפרפוסטה לאורך המעגל. מעגל הזילוח מתחיל במאגר המים המבודד. לאחר מכן, הפרפוזט מופנה דרך המחמצן, אשר מקבל תערובת גז של 95% חמצן ו -5% פחמן דו חמצני מבקבוק גז ייעודי. לאחר החמצון, הפרפוזט עובר דרך מלכודת הבועות, שבה כל הבועות הכלואות מנותבות חזרה למאגר על ידי המשאבה הפריסטלטית. הפרבוסט הנותר זורם דרך מחליף החום ונכנס לתא האיברים, משם הוא חוזר למאגר.
כאן, אנו מדווחים על ניסיוננו בהקמת NEVLP עבור כבדי עכברים וחולקים את התוצאות המבטיחות של ניסוי פיילוט שבוצע באמצעות התווך המחומצן ללא נשאי חמצן.
שלבים קריטיים בפרוטוקול
שני השלבים המכריעים בכריתת הכבד הם קנולציה של הווריד הפורטלי (PV) והקנולציה הבאה של צינור המרה (BD). צעדים אלה הם בעלי חשיבות עליונה בהבטחת שאיבת איברים מוצלחת והליכי זילוח או השתלה לאחר מכן.
אתגרים ופתרונות
קנולציית PV מציבה שלושה …
The authors have nothing to disclose.
לאורך כתיבת מאמר זה קיבלתי תמיכה וסיוע רבים. אני רוצה להודות במיוחד לחבר הצוות שלי XinPei Chen על שיתוף הפעולה הנפלא שלו ותמיכתו במטופלים במהלך הניתוח שלי.
0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
Arterial Clip | Braun | BH014R | |
Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
Petri Dishc 100×15 mm | VWR® | 391-0578 | |
Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
UT – 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |