Summary

Fotoacústica, Ultrassonografia e Angiotomografia Integradas (PAUSAT) para Imagem Não Invasiva do Cérebro Inteiro do Acidente Vascular Cerebral Isquêmico

Published: June 02, 2023
doi:

Summary

Este trabalho demonstra o uso de uma plataforma multimodal de imagem baseada em ultrassom para imagens não invasivas de acidente vascular cerebral isquêmico. Este sistema permite a quantificação da oxigenação sanguínea através de imagens fotoacústicas e a perfusão prejudicada no cérebro através da angiografia acústica.

Abstract

Apresentamos aqui um estudo experimental de AVC isquêmico usando nosso recém-desenvolvido sistema de imagem não invasivo que integra três tecnologias de imagem baseadas em acústica: fotoacústica, ultrassom e angiotomografia angiográfica (PAUSAT). A combinação dessas três modalidades ajuda a adquirir tomografia fotoacústica (TAP) multiespectral da oxigenação sanguínea cerebral, ultrassom de alta frequência do tecido cerebral e angiografia acústica da perfusão sanguínea cerebral. A plataforma de imagem multimodal permite o estudo das alterações de perfusão e oxigenação cerebral em todo o cérebro de camundongos após o AVC. Dois modelos de acidente vascular cerebral isquêmico comumente utilizados foram avaliados: o modelo de oclusão permanente da artéria cerebral média (pMCAO) e o modelo fototrombótico (TP). O PAUSAT foi usado para obter imagens dos mesmos cérebros de camundongos antes e depois de um AVC e analisar quantitativamente ambos os modelos de AVC. Esse sistema de imagem foi capaz de mostrar claramente as alterações vasculares cerebrais após o AVC isquêmico, incluindo redução significativa da perfusão sanguínea e da oxigenação na região do infarto do AVC (ipsilateral) em comparação com o tecido não lesado (contralateral). Os resultados foram confirmados por meio de imagens de contraste speckle a laser e pela coloração de cloreto de trifeniltetrazólio (TTC). Além disso, o volume de infarto sistólico em ambos os modelos de AVC foi medido e validado pela coloração TTC como a verdade fundamental. Através deste estudo, demonstramos que o PAUSAT pode ser uma ferramenta poderosa em estudos pré-clínicos não invasivos e longitudinais de acidente vascular cerebral isquêmico.

Introduction

O sangue transporta oxigênio (através da proteína da hemoglobina) e outros nutrientes importantes para os tecidos do nosso corpo. Quando o fluxo de sangue através dos tecidos é interrompido (isquemia), danos graves aos tecidos podem ocorrer, cujos efeitos mais imediatos são devidos à falta de oxigênio (hipóxia). O acidente vascular cerebral isquêmico é o resultado da interrupção do fluxo sanguíneo para uma determinada região do cérebro. O dano cerebral resultante de um acidente vascular cerebral isquêmico pode ocorrer em poucos minutos após o bloqueio do vaso e, muitas vezes, pode ter efeitos debilitantes e duradouros 1,2. Uma estratégia de grande valor para avaliar a fisiopatologia após AVC isquêmico e identificar e testar novos tratamentos é o uso de modelos de pequenos animais em laboratório. Os tratamentos descobertos em laboratório visam ser traduzidos para uso clínico e melhorar a vida dos pacientes. No entanto, o uso de animais em pesquisas biomédicas precisa ser cuidadosamente avaliado de acordo com os princípios dos 3Rs de Russell e Burch: substituição, redução e refinamento3. O objetivo do componente de redução é reduzir o número de animais sem comprometer a coleta de dados. Com isso em mente, a possibilidade de avaliar longitudinalmente a evolução da lesão por meio de imagens não invasivas permite uma grande vantagem na redução do número de animais necessários, bem como na maximização das informações obtidas de cadaanimal4.

A tomografia fotoacústica (TAP) é uma modalidade de imagem híbrida que combina contraste de absorção óptica com imagem de ultrassom de resoluçãoespacial5. O mecanismo de imagem do PAT é o seguinte. Um pulso de laser de excitação é iluminado no alvo que está sendo fotografado. Supondo que o alvo absorva luz no comprimento de onda do laser de excitação, ele aumentará de temperatura. Este rápido aumento da temperatura resulta em uma expansão termoelástica do alvo. A expansão faz com que uma onda de ultrassom se propague para fora do alvo. Ao detectar a onda de ultrassom em muitas posições, o tempo necessário para que a onda se propague do alvo para os detectores pode ser usado para criar uma imagem através de um algoritmo de reconstrução. A capacidade do PAT em detectar absorção óptica em regiões teciduais profundas diferencia o PAT do ultrassom, que detecta limites de diferentes impedâncias acústicas dostecidos5. Nos espectros do visível e do infravermelho próximo, as principais biomoléculas altamente absorventes e abundantes nos organismos são a hemoglobina, os lipídios, a melanina e a água7. De particular interesse no estudo do acidente vascular cerebral é a hemoglobina. Como a oxihemoglobina e a desoxihemoglobina têm espectros ópticos de absorção diferentes, o PAT pode ser usado com comprimentos de onda de laser de excitação múltipla para determinar a concentração relativa dos dois estados da proteína. Isso permite quantificar a saturação de oxigênio da hemoglobina (sO2), ou oxigenação sanguínea, dentro e fora da região do infarto 8,9. Esta é uma medida importante no AVC isquêmico, pois pode indicar o nível de oxigênio no tecido cerebral danificado após isquemia.

A angiografia acústica (AA) é um método de imagem ultrassonográfico com contraste que é particularmente útil para obter imagens da morfologia da vasculatura in vivo10. O método baseia-se no uso de um transdutor wobbler de elemento duplo (um elemento de baixa frequência e um elemento de alta frequência) em conjunto com microbolhas injetadas no sistema circulatório do sujeito da imagem. O elemento de baixa frequência do transdutor é usado para transmitir na frequência ressonante das microbolhas (por exemplo, 2 MHz), enquanto o elemento de alta frequência é usado para receber os sinais super harmônicos das microbolhas (por exemplo, 26 MHz). Quando excitadas em uma frequência ressonante, as microbolhas têm uma forte resposta não linear, resultando na produção de sinais superharmônicos que os tecidos corporais circundantes não produzem11. Ao receber com um elemento de alta frequência, isso garante que apenas os sinais de microbolhas sejam detectados. Como as microbolhas estão confinadas aos vasos sanguíneos, o resultado é uma imagem angiográfica da morfologia dos vasos sanguíneos. O AA é um método poderoso para a obtenção de imagens de acidente vascular cerebral isquêmico, pois as microbolhas que fluem através do sistema circulatório não são capazes de fluir através dos vasos bloqueados. Isso permite que o AA detecte regiões do cérebro que não são perfundidas devido ao AVC isquêmico, o que indica a região do infarto.

A pesquisa pré-clínica do AVC isquêmico geralmente se baseia no uso de histologia e testes comportamentais para avaliar a localização e a gravidade do AVC. A coloração com cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) é uma análise histológica comum usada para determinar o volume do infarto sistólico. No entanto, só pode ser utilizada em um ponto final, pois requer a eutanásiado animal 12. Testes comportamentais podem ser usados para determinar o comprometimento da função motora em múltiplos momentos, mas não podem fornecer valores anatômicos ou fisiológicos quantitativos13. A imagem biomédica fornece uma abordagem mais quantitativa para estudar os efeitos do AVC isquêmico de forma não invasiva e longitudinal 9,14,15. No entanto, as tecnologias de imagem existentes (como a ressonância magnética [RM] de pequenos animais) podem ter um alto custo, ser incapazes de fornecer informações estruturais e funcionais simultâneas ou ter profundidade de penetração limitada (como a maioria das técnicas de imagem óptica).

Aqui, combinamos fotoacústica, ultrassonografia e angiotomografia (PAUSAT; ver diagrama do sistema na Figura 1), que permite informações estruturais e funcionais complementares da perfusão e oxigenação sanguínea após acidente vascular cerebral isquêmico16. Esses são dois aspectos importantes na avaliação da gravidade da lesão e no monitoramento da recuperação ou resposta aos tratamentos. O uso desses métodos integrados de imagem pode aumentar a quantidade de informações obtidas por cada animal, reduzindo o número de animais necessários e fornecendo mais informações no estudo de possíveis tratamentos para AVC isquêmico.

Figure 1
Figura 1: Diagrama PAUSOT. (A) Esquema completo do sistema PAUSOT, incluindo o laser e o OPO utilizados para PAT. (B) Vista interna do sistema PAUSAT, incluindo dois transdutores de ultrassom. O transdutor wobbler de elemento duplo é usado para ultrassom modo B e AA, e o transdutor de arranjo linear é usado para PAT. Ambos os transdutores são montados no mesmo estágio motorizado 2D, permitindo a varredura para gerar dados volumétricos. Este número foi modificado de16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Duke University Medical Center e foram conduzidos de acordo com a Política de Cuidados Humanizados e Uso de Animais de Laboratório do Serviço de Saúde Pública dos Estados Unidos. Camundongos C57BL/6J machos e fêmeas (ver Tabela de Materiais) foram usados para esses estudos. Um mínimo de três animais foram fotografados por grupo modelo de AVC. Consulte a Figura 2 para obter…

Representative Results

Imagem da morfologia dos vasos sanguíneos no cérebroO AA gera imagens da morfologia dos vasos sanguíneos excitando microbolhas no sistema circulatório em sua frequência de ressonância e recebendo a resposta super harmônica das microbolhas. Usando a rampa personalizada (Figura 2C) acoplada a um estágio ajustável manualmente, podemos obter imagens do cérebro de camundongos com o modo AA em duas profundidades focais diferentes. Quando regiões mais profundas são …

Discussion

Existem alguns aspectos vitais desse método que, se feito incorretamente, pode levar a uma diminuição significativa da qualidade da imagem e da análise quantitativa. O resultado mais comum de erro do usuário em imagens PAUSAT é a falta de sinal ou a intensidade do sinal muito baixa, que podem ocorrer por uma variedade de razões. Um desses motivos é um problema com o acoplamento acústico. Grandes bolhas de ar na água ao redor da cabeça do mouse durante a imagem muitas vezes podem bloquear o ultrassom de viajar …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer à equipe de engenharia da SonoVol Inc. Este trabalho foi parcialmente patrocinado pelo American Heart Association Collaborative Sciences Award (18CSA34080277), para J. Yao e W. Yang; Os Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos (NIH) concedem R21EB027981, R21 EB027304, RF1 NS115581 (BRAIN Initiative), R01 NS111039, R01 EB028143; O prêmio CAREER da National Science Foundation (NSF) dos Estados Unidos 2144788; o Chan Zuckerberg Initiative Grant (2020-226178), a J. Yao; e concede R21NS127163 e R01NS099590 do NIH a W. Yang.

Materials

20 GA catheter BD Insyte Autoguard Winged 381534 For mouse intubation
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma T8877 Necessary for TTC-staining brain for validation
532nm Laser Quantel Q-smart 850 Laser used to pump the OPO for PAT
Automatic Ventilator Rovent Jr. Kent Scientific RV-JR To keep mice under anesthesia during surgical procedure
Black braided silk 4-0 USP Surgical Specialties SP116 Used for sutures on the neck for pMCAO surgery
Bupivacaine Hospira 0409-1159-18 Used prior to closing wounds during surgical procedure
C57BL/6 Mice Jackson Lab #000664 Mice used for studying ischemic stroke (2-6 month old male/female)
Clear suture Ethicon 8606 Used for closing wound (PT stroke and pMCAO). A clear suture won't interfere with PAT
Cold Light LED Schott KL 1600 Needed to create PT stroke
Disposable Razor Blade Accutec Blades 74-0002 For sectioning mouse brain
Electric drill JSDA JD-700 Used to expose MCA during pMCAO procedure
Electrocauterization tool Wet-Field Wet-Field Bipolar-RG Stops blood flow after drilling during pMCAO procedure
Hair removal gel Veet 8282651 Used to remove hair from mouse prior to imaging
High Temperature Cautery Loop Tip BOVIE Medical Corporation REF AA03 Used to avoid bleeding when separating the temporal muscle from the skull
IR Detector Card Thorlabs VRC5 Used to ensure light path is aligned
Laser Power Meter Ophir StarBright, P/N 7Z01580 Can be used to calibrate the laser energy prior to imaging
Laser Speckle Imaging System RWD Life Science Co. RFLSI-III Can be used to validate stroke surgery success
Lubricant Eye Ointment Soothe AB31336 Can be used to avoid drying of the eyes
Manually adjustable stage Thorlabs L490 Used with custom ramp for multiple focal depth AA imaging
Modified Vega Imaging System Perkin Elmer LLA00061 System containing both B-mode/AA and PAT transducers
Optical Parametric Oscillator Quantel versaScan-L532 Allows for tuning of excitation wavelength in a large range
Programmable Ultrasound System Verasonics Vantage 256 Used for PAT part of system
Rose Bengal Sigma 330000 Necessary to induce PT stroke
Suture LOOK SP116 Used for permanent ligation of CCA
Temperature Contoller Physitemp TCAT-2 Used to maintain stable body temperature of mice during procedures
VesselVue Microbubbles Perkin Elmer P-4007001 Used for acoustic angiography (2.43 × 10^9 microbubbles/mL)

References

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Menozzi, L., del Águila, Á., Vu, T., Ma, C., Yang, W., Yao, J. Integrated Photoacoustic, Ultrasound, and Angiographic Tomography (PAUSAT) for NonInvasive Whole-Brain Imaging of Ischemic Stroke. J. Vis. Exp. (196), e65319, doi:10.3791/65319 (2023).

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