本文描述了构建和操作冷却阶段以将秀丽隐杆线虫集体固定在其原始培养板上的协议。
高分辨率体内显微镜方法可以揭示模型动物秀丽隐杆线虫(秀丽隐杆线虫)内部的微妙信息和精细细节,但需要强烈的动物固定以防止图像中的运动模糊。不幸的是,大多数当前的固定技术都需要大量的手动工作,使得高分辨率成像的通量很低。秀丽隐杆线虫的固定化通过使用冷却方法大大简化,该方法可以轻松地将整个种群直接固定在其培养板上。冷却阶段可以建立并保持广泛的温度范围,并在培养板上均匀分布。在本文中,记录了构建冷却阶段的整个过程。目的是典型的研究人员可以毫无困难地按照此协议在实验室中构建操作冷却阶段。显示了以下三种方案对冷却阶段的利用,每种方案对于不同的实验都有优势。还显示了接近最终温度的载物台冷却曲线示例,以及使用冷却固定的一些有用技巧。
高分辨率光学显微镜为亚细胞水平的体内生物结构研究提供了不可或缺的工具。许多生物学研究需要亚微米分辨率成像来解析细微的解剖细节,包括神经元形态1,2,膜结构3,4和蛋白质定位5,6。高分辨率图像需要几毫秒到几秒钟的曝光时间,具体取决于成像模式和探头7,8。为了获得最佳结果,必须仔细计划和进行基于显微镜的实验。这项工作的关键是一种有效的动物制备方法,该方法有助于高分辨率成像。
线虫秀丽隐杆线虫是一种广泛使用的模式生物,用于研究许多生物过程9。这种小动物通常在线虫生长培养基(NGM)琼脂平板上培养,它们通过自我受精快速繁殖,非常适合大规模研究。它们的透明度和广泛的标记技术允许直接可视化其内部解剖结构10,11。秀丽隐杆线虫中的精细结构非常适合研究亚细胞水平的生物过程,例如神经元再生 12、神经元变性13 和细胞分裂14。此类研究需要亚微米分辨率成像和足够强的动物固定以防止图像模糊。对于涉及空间或时间上的多个图像的技术,例如3D图像堆栈(即z堆栈)和延时成像,强固定化尤其重要。暴露之间的任何动物运动都会掩盖结果。对于秀丽隐杆线虫,强固定通常涉及手动操作单个动物并用麻醉剂将它们安装在载玻片上 15,16。这些时间和劳动密集型程序使大规模实验变得非常困难。将动物直接和可逆地固定在其原始培养板上的固定策略可以实现高通量高分辨率成像。
秀丽隐杆线虫的冷却固定已在少数研究中显示,但并未广泛使用。它通常与微流体装置结合使用以进一步抑制动物17,18,19。然而,微流体装置很复杂,需要大量的操作培训,并且不能轻易地与秀丽隐杆线虫实验的典型固体培养工作流程集成。因此,微流体并未广泛用于秀丽隐杆线虫固定化。这里结合Chung实验室最近的出版物20,引入了一种新的冷却固定方法,使用热电冷却阶段(图1)来解决这些缺点。通过冷却阶段,典型的60 mm聚苯乙烯培养板可以冷却到-8°C至室温之间的任何目标温度(T组)。这种冷却阶段方法可以以最少的用户工作量轻松且可逆地固定整个动物种群,从而消除了98%的动物处理时间20。
下面描述了从头开始构建冷却阶段的过程。除了零件加工和3D打印外,整个过程预计需要4小时,无需特殊工具或专业知识。然后,进一步描述了三种不同的冷却策略,这些策略具有不同的冷却速率和用户在典型的正置显微镜上固定秀 丽隐杆线虫 的努力。首选策略可能取决于用户应用程序。详细描述了这三种冷却固定策略的协议。
冷却阶段的制造、组装和使用在本手稿中显示。大多数组件都是可以在线购买的现成物品。一些组件,如铜板和蓝宝石窗口,需要定制订单,可能需要长达 1 个月的时间来制造。其他可以3D打印的组件在大多数研究机构中很容易制造(补充表1)。组装过程只需要几个工具,非专家可以在几个小时内快速完成。因此,大多数生物实验室应该能够轻松实现该设备。
冷却阶段和冷却固定方法与现有的固定方法相比具有几个显着的改进,在原始出版物20中仔细详细说明。简而言之,冷却阶段能够在标准显微镜工作流程下将包括胚胎和道尔在内的所有年龄段的 大量秀丽隐杆线虫 强力固定在其典型培养板上。它消除了对复杂硬件设置(如微流体)的需求,同时提供了更强的固定效果。此外,由于不使用化学品,它最大限度地减少了对动物和研究人员可能的有毒化学物质暴露,同时提供类似的固定效果。这些技术能力使该设备和方法能够广泛应用于许多需要对大量动物进行高分辨率 体内 显微镜的实验。
在构建设备的过程中有一些关键步骤,包括所有导热膏应用和将蓝宝石窗口固定到铜板上的宽胶带。导热膏通过用低热阻材料代替间隙来确保强大的导热性。为了达到所需的冷却性能,需要在所有相邻/接触表面之间正确引入浆料,包括帕尔贴冷表面到铜板,帕尔贴热表面到铜冷却块,铜板到蓝宝石窗口。应用于舞台的宽胶带隔离铜板,以防止空气加热和冷凝,从而导致生锈。它还加强了蓝宝石窗口和铜板之间的联系。因此,使用导热膏和宽胶带都需要格外小心。
在实际的冷却固定实验中,本手稿中提供的参数(例如电压和时间)取决于培养板和阶段的特定特性,例如平板中琼脂的量,阶段的效率以及环境温度和湿度。在未来的修改中,可以安装一个反馈控制器,如比例积分微分(PID),以主动调节冷却阶段的电压输入,以达到所需的温度并使其稳定。
这种冷却阶段固定有几个局限性,在原始出版物20中仔细详细说明。简而言之,在不同温度下饲养的动物被固定到不同程度,这可能需要额外的微调。此外,目前的冷却阶段不是为倒置显微镜设计的。此外,直接在培养板上成像或筛选可能会将污染引入培养盘。
我们正在设计适用于不同成像平台的新版本冷却台,包括复合正置显微镜和倒置显微镜。这些新设计将允许在这些平台上成像期间直接将动物冷却固定在培养板上。这些冷却阶段的成像将使用长工作距离的空气浸没物镜,类似于直立配置。如今,空气浸没物镜的数值孔径可达0.9,可为绿色荧光蛋白成像提供约300 nm的分辨率。因此,新的冷却台与显微镜的结合可以常规地进行亚微米分辨率的荧光成像。
我们还根据我们的经验提供了一些使用冷却阶段的有用提示。例如,个人应检查水冷组件内是否有气泡。气泡会降低帕尔贴热表面的冷却效果,从而降低冷却阶段的冷却效果。如果存在气泡,应打开 12 V 电源以使水流动,并且应摇动水流的所有组件。气泡可以从被困区域冲洗出来,并由泵箱排出。研究人员在组装水冷组件时应确保水流管不弯曲或交叉。弯管或交叉可能会阻止足够的水流并降低冷却效率。管连接应正确贴合和紧密。如有必要,可以使用不同直径的软管来代替以确保密封性。即使连接不够紧密,也不应使用糊剂,因为膏体可能会在将来的使用中引入堵塞。室内湿度会影响冷却性能,并在冷却阶段引入冷凝和结冰。在将培养板放在冷却台上之前,建议使用纸巾去除冷凝或使用散热器快速去除蓝宝石窗口上形成的冰。如果泵箱和散热器风扇在同一台上工作,它们可能会在显微镜中引起小振动。显微镜振动会使采集到的图像模糊,因此应避免。垫子可用于机械绝缘水箱和散热器,也可以将它们放在附近的单独桌子上。冷却阶段可以通过反转与帕尔贴的电气连接而成为加热阶段。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢诺亚·约瑟夫(东北生物工程系)的铜板加工。
12-V power supply | ANYTITI | ledpower00 | output DC 12V +/-0.5V, 5A power 60W |
8-32 screw | arbitrary | for bracket fixation | |
bracket | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
breadboard | DEYUE | 7545924028 | 400 pin solderless board kit for DIY electric connection |
copper cooling block | Kalolary | Kalolary-Heatsink001 | 40*40mm internal fin thickness 0.5mm |
copper plate | arbitrary | N/A | Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet. See supplementary for 2D drawing for manufacturing. |
digital thermocouple thermometer | Proster | 4333090752 | dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes measuring range -50-300°C accuracy ±1.5% resolution 0.1°C /°F < 1000° |
isolation base | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
jumper wires | arbitrary | for electronic connection | |
multistage peltier | DigiKey | TEC1-12706 | thermoelectric cooling device size 40*40*7.05 mm Umax 16.1 V Imax 8.5 A ΔTmax @ Th 85°C @ 27°C Qmax @ Th 51.6W @ 27°C resistance 1.65 Ω |
Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing | ThermoScientific | 14-176-332E | ultrasoft tube durometer hardness Shore A, 50 inner diameter 1/4 in outer diameter 9.5 mm |
packaging tape | arbitrary | 4 inch wide to cover the copper plate | |
pump tank | Yosoo | SC-300T | input power DC 12V flow rate 300L/h max |
radiator | DIYhzWater | 10463 | 12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans |
sapphire window | Altos Photonics, Inc. | N/A | Contact Altos for custom order size Ø 80mm, 3mm thick surface quality 60-40s/d uncoated |
thermal paste | Corsair | XTM50 | reduce thermal impedance between surfaces thermal conductivity 5.0W/mK |
tunable power supply | Kungber | DY-SPS3010B | voltage range 0 – 30V current range 0 – 10A linear Power Supply with 4-Digits coarse and fine adjustments with alligator leads |