Summary

Fare Dorsal Kök Ganglion Kriyoseksiyonu için Bir Prosedür

Published: June 09, 2023
doi:

Summary

Burada sunulan, sürekli olarak yüksek kaliteli dorsal kök ganglion kriyostat kesitleri elde etmek için yapılan geliştirmedir.

Abstract

Yüksek kaliteli fare dorsal kök ganglionu (DRG) kriyostat kesitleri, enflamatuar ve nöropatik ağrı, kaşıntı ve diğer periferik nörolojik durumların araştırılmasında uygun immünokimya boyama ve RNAscope çalışmaları için çok önemlidir. Bununla birlikte, DRG dokusunun küçük numune boyutu nedeniyle cam slaytlar üzerinde tutarlı bir şekilde yüksek kaliteli, sağlam ve düz kriyostat bölümleri elde etmek bir zorluk olmaya devam etmektedir. Şimdiye kadar, DRG kriyoseksiyonu için en uygun protokolü açıklayan bir makale bulunmamaktadır. Bu protokol, DRG kriyoseksiyonu ile ilgili sık karşılaşılan zorlukları çözmek için adım adım bir yöntem sunar. Sunulan makale, DRG doku örneklerinden çevreleyen sıvının nasıl çıkarılacağını, DRG bölümlerinin aynı yöne bakacak şekilde slayt üzerine nasıl yerleştirileceğini ve cam slayt üzerindeki bölümlerin yukarı kıvrılmadan nasıl düzleştirileceğini açıklamaktadır. Bu protokol DRG örneklerinin kriyoseksiyonu için geliştirilmiş olmasına rağmen, küçük bir örnek boyutuna sahip diğer birçok dokunun kriyokesiti için uygulanabilir.

Introduction

Dorsal kök ganglionu (DRG), birincil duyusal nöronları, doku makrofajlarını ve birincil duyusal nöronları çevreleyen uydu hücreleriniiçerir 1,2,3,4. Zararsız ve zararlı sinyallerin işlenmesinde önemli bir anatomik yapıdır ve ağrı, kaşıntı ve çeşitli periferik sinir bozukluklarında kritik rol oynar 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Fare omuriliğinden DRG dokusunu incelemek için çeşitli yöntemler geliştirilmiş olsa da14,15,16, DRG dokusu oldukça küçük olduğundan ve DRG örneklerinin kriyostat bölümleri rulolar halinde kıvrılma eğiliminde olduğundan DRG dokusunun kriyoseksiyonu zor olmaya devam etmektedir, bu da kriyostat bölümlerinin cam slaytlara düzgün bir şekilde aktarılmasını zorlaştırır. Bununla birlikte, DRG dokusunun uygun kriyoseksiyonu, immünohistokimya çalışmaları ve DRG duyusal nöronlarının yapısı için çok önemlidir 17,18,19,20,21,22,23. Ayrıca, tek hücreli RNA dizileme sonuçları, hem insanlarda24 hem de farelerde25 DRG duyusal nöronlarının dikkate değer heterojenliğini ortaya çıkardığından, DRG dokusunun uygun şekilde kriyoseksiyonu, çeşitli fizyolojik ve patolojik durumlarda farklı DRG hücrelerinin fonksiyonel rolünü araştırmak için kritik öneme sahiptir.

DRG’nin kriyoseksiyonunun alternatif bir tekniği olarak DRG26’nın 3D rekonstrüksiyonunu araştırmak için doku temizleme tekniği uygulanmış olsa da, doku temizleme tekniği zaman ve emek alıcıdır. Buna karşılık, DRG’nin kriyoseksiyonu hızlı ve nispeten kolaydır ve bu nedenle DRG’nin ve merkezi sinir sisteminin diğer bölgelerinin immünohistokimyası ve yapı çalışmaları için anahtar bir teknik olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, cam slaytlar üzerine yüksek kaliteli, sağlam ve düz kriyostat kesitleri elde etmek, DRG ve belirli beyin bölgeleri gibi dokuların küçük örneklem boyutu nedeniyle sinirbilim araştırmalarında bir zorluk olmaya devam etmektedir ve bu noktada fare DRG’leri gibi küçük boyutlu doku örneklerinin kriyoseksiyonu için en uygun protokolü açıklayan bir makale yoktur.

Bu protokol, sonraki DRG çalışmaları için slaytlar üzerinde güvenilir bir şekilde çok sayıda yüksek kaliteli DRG kesiti elde etmek için fare DRG’sinin kriyostat kesiti için kolay, adım adım bir teknik sağlar. DRG numunelerinin kriyoseksiyonu için özel olarak tasarlanmış olsa da, bu teknik, küçük numune boyutuna sahip diğer çeşitli dokuların kriyoseksiyonu için potansiyel olarak kullanılabilir.

Protocol

Bu çalışma için, hayvan deneyleri UCSF Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu’na uygun olarak yürütüldü. Burada yetişkin, 8-12 haftalık C57BL / 6 erkek ve dişi fareler (evde yetiştirilmiş) kullanıldı. 1. DRG numune hazırlama Fareleri% 2.5 Avertin ile uyuşturun (Malzeme Tablosuna bakınız). Ağrılı stimülasyona yanıt verilmemesi nede…

Representative Results

Mevcut çalışma, bir fare L4 DRG’den yaklaşık 16 sürekli, yüksek kaliteli DRG bölümü topladı. Elde edilen kesitlerde herhangi bir bozulma yoktu. Şekil 1 , kriyoseksiyon için adım adım prosedürü göstermektedir. Doku kesitlerinden fazla sıvının uzaklaştırılması Şekil 2’de gösterilmiştir. Dokuların OCT gömülmesi süreci Şekil 3’te vurgulanmıştır. Şekil 4 , DRG bölümleri…

Discussion

Bu protokol, slaytlar üzerinde güvenilir bir şekilde yüksek kaliteli DRG kesitleri elde etmek için fare DRG’sinin kriyostat kesitleri için adım adım kolay bir prosedür sağlar. Bu protokolde dört kritik adım vardır. İlk olarak, DRG numunesini OCT tabanına koymadan önce DRG numunesi ve cımbız kuru olmalıdır. DRG örneğini çevreleyen herhangi bir sıvı, etrafında bir buz kabuğu oluşturacak ve DRG bölümlerinin OCT’den ayrılmasına ve yukarı doğru kıvrılmasına neden olacaktır. İkincisi, al?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Hiç kimse.

Materials

Avertin Sigma-Aldrich T48402-25G Anesthetize animal
Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched Fisherbrand 1910 Hold the OCT section at the bottom 
Ergo Tweezers Fisherbrand S95310 Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll 
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 1255015 To collect the DRG section 
Marking pens Fisherbrand 133794  Mark the orientation of base OCT
Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound Fisherbrand  23730571 Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.).

References

  1. Guan, Z., et al. Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain. Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).
  2. Yu, X., et al. Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain. Nature Communications. 11 (1), 264 (2020).
  3. Costa, F. A. L., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Brazilian Journal of Anesthesiology. 65 (1), 73-81 (2015).
  4. Noguri, T., Hatakeyama, D., Kitahashi, T., Oka, K., Ito, E. Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression. Molecular Brain. 15 (1), 44 (2022).
  5. Su, P. P., Zhang, L., He, L., Zhao, N., Guan, Z. The role of neuro-immune interactions in chronic pain: implications for clinical practice. Journal of Pain Research. 15, 2223-2248 (2022).
  6. Esposito, M. F., Malayil, R., Hanes, M., Deer, T. Unique characteristics of the dorsal root ganglion as a target for neuromodulation. Pain Medicine. 20, S23-S30 (2019).
  7. Chen, X. J., Sun, Y. G. Central circuit mechanisms of itch. Nature Communications. 11 (1), 3052 (2020).
  8. Guan, Z., Hellman, J., Schumacher, M. Contemporary views on inflammatory pain mechanisms: TRPing over innate and microglial pathways. F1000Research. , (2016).
  9. Boadas-Vaello, P., et al. Neuroplasticity of ascending and descending pathways after somatosensory system injury: reviewing knowledge to identify neuropathic pain therapeutic targets. Spinal Cord. 54 (5), 330-340 (2016).
  10. Guha, D., Shamji, M. F. The dorsal root ganglion in the pathogenesis of chronic neuropathic pain. Neurosurgery. 63, 118-126 (2016).
  11. Shorrock, H. K., et al. UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy. Brain. 141 (10), 2878-2894 (2018).
  12. Sleigh, J. N., et al. Trk receptor signaling and sensory neuron fate are perturbed in human neuropathy caused by Gars mutations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (16), E3324-E3333 (2017).
  13. Rubio, M. A., Herrando-Grabulosa, M., Gaja-Capdevila, N., Vilches, J. J., Navarro, X. Characterization of somatosensory neuron involvement in the SOD1(G93A) mouse model. Scientific Reports. 12 (1), 7600 (2022).
  14. Sleigh, J. N., West, S. J., Schiavo, G. A video protocol for rapid dissection of mouse dorsal root ganglia from defined spinal levels. BMC Research Notes. 13 (1), 302 (2020).
  15. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
  16. Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
  17. Haberberger, R. V., Barry, C., Matusica, D. Immortalized dorsal root ganglion neuron cell lines. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 184 (2020).
  18. Pokhilko, A., Nash, A., Cader, M. Z. Common transcriptional signatures of neuropathic pain. Pain. 161 (7), 1542-1554 (2020).
  19. Martin, S. L., Reid, A. J., Verkhratsky, A., Magnaghi, V., Faroni, A. Gene expression changes in dorsal root ganglia following peripheral nerve injury: roles in inflammation, cell death and nociception. Neural Regeneration Research. 14 (6), 939-947 (2019).
  20. Miller, R. J., Jung, H., Bhangoo, S. K., White, F. A. Cytokine and chemokine regulation of sensory neuron function. Handbook of Experimental Pharmacology. (194), 417-449 (2009).
  21. Neto, E., et al. Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3D organotypic cultures of adult dorsal root ganglia. PLoS One. 12 (7), e0181612 (2017).
  22. Nascimento, A. I., Mar, F. M., Sousa, M. M. The intriguing nature of dorsal root ganglion neurons: Linking structure with polarity and function. Progress in Neurobiolology. 168, 86-103 (2018).
  23. Middleton, S. J., Perez-Sanchez, J., Dawes, J. M. The structure of sensory afferent compartments in health and disease. Journal of Anatomy. 241 (5), 1186-1210 (2022).
  24. Nguyen, M. Q., von Buchholtz, L. J., Reker, A. N., Ryba, N. J., Davidson, S. Single-nucleus transcriptomic analysis of human dorsal root ganglion neurons. eLife. 10, e71752 (2021).
  25. Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
  26. Hunt, M. A., et al. DRGquant: A new modular AI-based pipeline for 3D analysis of the DRG. Journal of Neuroscience Methods. 371, 109497 (2022).

Play Video

Cite This Article
He, L., Zhao, W., Zhang, L., Ilango, M., Zhao, N., Yang, L., Guan, Z. A Procedure for Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning. J. Vis. Exp. (196), e65232, doi:10.3791/65232 (2023).

View Video