Summary

Verrijking van inheemse en recombinante extracellulaire blaasjes van mycobacteriën

Published: December 08, 2023
doi:

Summary

Dit protocol beschrijft de verrijking van inheemse mycobacteriële extracellulaire vesikels (mEV’s) uit axenische culturen van Mycobacterium smegmatis (Msm) en hoe mCherry (een rode fluorescerende reporter)-bevattende recombinante MsmEV’s kunnen worden ontworpen en verrijkt. Ten slotte verifieert het de nieuwe aanpak met de verrijking van MsmEV’s die het EsxA-eiwit van Mycobacterium tuberculosis bevatten.

Abstract

De meeste bacteriën, waaronder mycobacteriën, genereren extracellulaire blaasjes (EV’s). Aangezien bacteriële EV’s (bEV’s) een subset van cellulaire componenten bevatten, waaronder metabolieten, lipiden, eiwitten en nucleïnezuren, hebben verschillende groepen de native of recombinante versies van bEV’s geëvalueerd op hun beschermende potentie als subeenheid-vaccinkandidaten. In tegenstelling tot native EV’s zijn recombinante EV’s moleculair gemanipuleerd om een of meer immunogenen van belang te bevatten. In het afgelopen decennium hebben verschillende groepen verschillende benaderingen onderzocht voor het genereren van recombinante bEV’s. Hier rapporteren we echter het ontwerp, de constructie en de verrijking van recombinante mycobacteriële EV’s (mEV’s) in mycobacteriën. Daarvoor gebruiken we Mycobacterium smegmatis (Msm), een avirulente bodemmycobacterie als modelsysteem. We beschrijven eerst de generatie en verrijking van native EV’s van Msm. Vervolgens beschrijven we het ontwerp en de constructie van recombinante mEV’s die ofwel mCherry bevatten, een rood fluorescerend reportereiwit, ofwel EsxA (Esat-6), een prominent immunogeen van Mycobacterium tuberculosis. Dit bereiken we door mCherry en EsxA N-termini afzonderlijk te fuseren met de C-terminus van een klein Msm-eiwit Cfp-29. Cfp-29 is een van de weinige overvloedig aanwezige eiwitten van MsmEV’s. Het protocol voor het genereren en verrijken van recombinante mEV’s uit Msm blijft identiek aan het genereren en verrijken van native EV’s van Msm.

Introduction

Ondanks de ontwikkeling en toediening van een breed scala aan vaccins tegen infectieziekten, vindt zelfs tot op de dag van vandaag ~30% van alle menselijke sterfgevallen nog steeds plaats door overdraagbare ziekten. Vóór de komst van het tuberculosevaccin (tbc) – Bacillus Calmette Guerin (BCG) – was tuberculose doodsoorzaak nummer één (~10.000 tot 15.000/100.000 inwoners)2. Met de toediening van BCG en gemakkelijke toegang tot eerste- en tweedelijns anti-tbc-medicijnen, is het aantal tbc-gerelateerde sterfgevallen in 2022 dramatisch gedaald tot ~1 miljoen/jaar in 2022 (d.w.z. ~15-20/100.000 inwoners1). In tbc-endemische populaties van de wereld blijven tbc-gerelateerde sterfgevallen echter ~100-550/100.000 inwoners1. Hoewel experts verschillende redenen erkennen die tot deze scheve cijfers leiden, lijkt BCG-gemedieerde bescherming die zelfs het eerste decennium van het leven niet duurt, de belangrijkste reden te zijn 3,4,5,6,7. Bijgevolg is er, gezien de vernieuwde ‘Sustainable Development Goals’ van de VN en de ‘End TB Strategy’ van de WHO, een gezamenlijke wereldwijde inspanning om een veel beter vaccinalternatief voor BCG te ontwikkelen dat misschien levenslange bescherming tegen tuberculose biedt.

Om dat doel te bereiken, evalueren verschillende groepen momenteel gemodificeerde/recombinante BCG-stammen, niet-pathogene en verzwakte mycobacteriële soorten anders dan BCG, en subeenheidkandidaten 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Doorgaans zijn subeenheidvaccins liposomen die selectief zijn geladen met enkele gezuiverde (~1-6) volledige of afgeknotte immunogene eiwitten van de ziekteverwekker. Echter, vanwege hun onechte vouwen in niet-inheemse conformaties en/of willekeurige niet-functionele interacties tussen de geladen eiwitten, missen subeenheden vaak native en germane epitopen en slagen ze er daarom niet in om het immuunsysteem voldoende te primen14,19,20.

Bijgevolg zijn extracellulaire blaasjes (EV’s) van bacteriën in een stroomversnelling gekomen als een veelbelovend alternatief 21,22,23,24,25,26. Doorgaans bevatten bacteriële EV’s (bEV’s) een subset van hun cellulaire componenten, waaronder enkele delen nucleïnezuren, lipiden en honderden metabolieten en eiwitten27,28. In tegenstelling tot liposomen waar een paar gezuiverde eiwitten kunstmatig worden geladen, bevatten bEV’s honderden natuurlijk geladen, native-gevouwen eiwitten met een betere neiging om het immuunsysteem te stimuleren, vooral zonder de boost/hulp van adjuvantia en Toll-like receptor (TLR) agonisten27,28,29. Het is in deze onderzoekslijn dat wij en anderen het nut van mycobacteriële EV’s hebben onderzocht als potentiële subunit-boosters voor BCG30. Ondanks de bezorgdheid dat bEV’s geen uniforme antigeenbelasting hebben, hebben EV’s van verzwakte Neisseria meningitidis mensen met succes beschermd tegen serogroep B-meningokokken31,32.

In ieder geval theoretisch zijn de beste EV’s die BCG goed zouden kunnen stimuleren de EV’s die zijn verrijkt met pathogene bacteriën. Het verrijken van EV’s gegenereerd door pathogene mycobacterium is echter duur, tijdrovend en riskant. Bovendien kunnen door ziekteverwekkers gegenereerde EV’s virulenter dan beschermend zijn. Gezien de potentiële risico’s rapporteren we hier een goed getest protocol voor de verrijking van EV’s gegenereerd door axenisch gekweekte Msm, een avirulente mycobacterie.

Ondanks het feit dat ze coderen voor verschillende orthologen van pathogene eiwitten, missen avirulente mycobacteriën verschillende vaccinantigenen/pathogene eiwitepitopen die nodig zijn om het immuunsysteem voldoende voor te bereiden op bescherming33. Daarom hebben we ook onderzoek gedaan naar het construeren en verrijken van recombinante EV’s van Msm door middel van moleculaire engineering, zodat een aanzienlijk deel van elk pathogeen eiwit dat van belang is en wordt uitgedrukt en vertaald in Msm, zijn EV’s moet bereiken. We veronderstelden dat een of meer van de top 10 overvloedige eiwitten van Msm EV’s, wanneer ze worden gefuseerd met het eiwit van belang, zullen helpen bij een dergelijke translocatie.

Terwijl we begonnen met het standaardiseren van de verrijking van mycobacteriële EV’s (mEV’s) in ons laboratorium, rapporteerden Prados-Rosales et al. in 2011 voor het eerst de visualisatie en verrijking van mEV’s in vitro30. Later, in 2014, publiceerde dezelfde groep een aangepaste versie van hun methode uit 201134. In 2015 rapporteerden Lee et al. ook een onafhankelijk gestandaardiseerde methode voor mEV-verrijking, opnieuw uit axenische culturen van mycobacteriën35. Door beide protocollen 34,35 te combineren en enkele van onze wijzigingen op te nemen na grondige standaardisatie, beschrijven we hier een protocol dat helpt bij het routinematig verrijken van mEV’s uit axenische culturen van mycobacteriën36.

Hier beschrijven we in het bijzonder de verrijking van Msm-specifieke EV’s, wat een uitbreiding is van een gepubliceerd protocol36 voor de verrijking van mycobacteriële EV’s in het algemeen. We beschrijven ook hoe we recombinante mEV’s (R-mEV’s) kunnen construeren die het mCherry-eiwit bevatten (als een rode fluorescerende reporter) en EsxA (Esat-6)37,38,39, een overheersend immunogeen en een potentiële subeenheid vaccinogeen van Mycobacterium tuberculosis. Het protocol voor het verrijken van de R-mEV’s blijft identiek aan het protocol dat we hebben beschreven voor het verrijken van native EV’s van Msm.

Protocol

1. Groeiomstandigheden van Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli en hun derivaten MediaMiddlebrook 7H9 vloeibare bouillonBereid 20% Tween-80 bouillonoplossing door het benodigde volume dubbel gedestilleerd water (ddw) in een glazen bekerglas voor te verwarmen tot ~45-50 °C in een magnetron, voeg het vereiste volume Tween-80 toe met behulp van een geschikte maatcilinder en roer continu op een kleine magnetische r…

Representative Results

We gebruiken M. smegmatis (Msm) als model mycobacterium om de verrijking van zowel native als recombinante mEV’s (R-mEV’s) aan te tonen. Dit schematisch samengevatte mEV’s verrijkingsprotocol (Figuur 1) werkt ook voor de verrijking van R-mEV’s van Msm en native EV’s van Mtb (met kleine aanpassingen zoals in protocolnotities van 1.2). Voor de visualisatie van de verrijkte mEV’s moeten ze negatief worden gekleurd onder een transmissie-elektronenmicroscoop36 (<s…

Discussion

Aangezien het ontwikkelen van een nieuw tbc-vaccin dat superieur is aan BCG en het kan vervangen, een formidabele uitdaging blijft, streven verschillende groepen als alternatief naar de ontdekking van verschillende subeenheid tbc-vaccins die de potentie van BCG kunnen vergroten en de beschermende duur kunnen verlengen48,49. Gezien de toenemende aandacht voor bacteriële EV’s (bEV’s) als potentiële subeenheden en als natuurlijke hulpstoffen50,51…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs danken Prof. Sarah M. Fortune oprecht voor het vriendelijk delen van M. smegmatis mc2155 voorraad. Ze erkennen ook Servier Medical Art (smart.servier.com) voor het leveren van enkele basiselementen voor figuur 1. Ze erkennen oprecht de steun van de rest van de laboratoriumleden voor hun patiëntaanpassingen tijdens het lange gebruik van de couveuseschudders, centrifuges en ultracentrifuges voor mEV-verrijking. Ze erkennen ook de heer Surjeet Yadav, de laboratoriumassistent, omdat hij er altijd voor zorgde dat het benodigde glaswerk en verbruiksartikelen altijd beschikbaar en handig waren. Ten slotte erkennen ze de administratieve, aankoop- en financiële teams van THSTI voor hun constante ondersteuning en hulp bij de naadloze uitvoering van het project.

Materials

A2 type Biosafety Cabinet Thermo Fisher Scientific, USA 1300 series
Bench top Centrifuge Eppendorf, USA 5810 R
BstB1, HindIII, HpaI NEB, USA NEB
Cell densitometer GE Healthcare, USA Ultraspec 10
Citric Acid Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Double Distilled Water Merck, USA ~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes Bio-Rad, USA 2 mm
Electroporator Bio-Rad, USA Electroporator
EsxA-specific Ab Abcam, UK Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Floor model centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA Sorvall RC6 plus
Glassware Borosil, INDIA 1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Incubator shakers Thermo Fisher Scientific, USA MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller Hi Media, INDIA Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Magnetic stirrer Tarsons, INDIA Tarsons
mCherry-specific Ab Abcam, UK Rabbit monoclonal
Microwave LG, INDIA MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth BD, USA Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment BD, USA BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, USA Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a NEB, USA a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol) Merck, USA Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit Hi Media, INDIA Hi Media
pH Meter Mettler Toledo, USA Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit Hi Media, INDIA Hi Media
Plate incubator Thermo Fisher Scientific, USA New Series
Plasmid pMV261 Addgene, USA *
*The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank
Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific, USA Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase NEB, USA NEB
Refrigerated circulating water bath Thermo Fisher Scientific, USA R20
Middlebrock 7H11 Agar base BD, USA BBL Seven H11 Agar base
SOC broth Hi Media, INDIA Hi Media
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase NEB, USA NEB
Tween-80 Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Ultracentrifuge Beckman Coulter, USA Optima L100K
Ultracentrifuge tubes – 14 mL Beckman Coulter, USA Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes – 38 mL Beckman Coulter, USA Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator Thermo Fisher Scientific, USA Sonicator – bench top model
0.22 µm Disposable filters Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators Merck, USA Amicon Ultra centrifugal filters – Millipore
3X FLAG antibody Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes Corning, USA Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli NEB, USA NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG This study MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm) Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA  MC2 155

References

  1. . Global Tuberculosis Report 2022. , (2022).
  2. Luca, S., Mihaescu, T. History of BCG vaccine. Mædica. 8 (1), 53-58 (2013).
  3. Palmer, C. E., Long, M. W. Effects of infection with atypical mycobacteria on BCG vaccination and tuberculosis. The American Review of Respiratory Disease. 94 (4), 553-568 (1966).
  4. Brandt, L., et al. Failure of the Mycobacterium bovis BCG vaccine: some species of environmental mycobacteria block multiplication of BCG and induction of protective immunity to tuberculosis. Infection and Immunity. 70 (2), 672-678 (2002).
  5. Andersen, P., Doherty, T. M. The success and failure of BCG – implications for a novel tuberculosis vaccine. Nature Reviews. Microbiology. 3 (8), 656-662 (2005).
  6. Kumar, P. A perspective on the success and failure of BCG. Frontiers in Immunology. 12, 778028 (2021).
  7. Fine, P. E. Variation in protection by BCG: implications of and for heterologous immunity. Lancet. 346 (8986), 1339-1345 (1995).
  8. Triccas, J. A. Recombinant BCG as a vaccine vehicle to protect against tuberculosis. Bioengineered Bugs. 1 (2), 110-115 (2010).
  9. Dietrich, G., Viret, J. -. F., Hess, J. Mycobacterium bovis BCG-based vaccines against tuberculosis: novel developments. Vaccine. 21 (7-8), 667-670 (2003).
  10. Singh, V. K., Srivastava, R., Srivastava, B. S. Manipulation of BCG vaccine: a double-edged sword. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (4), 535-543 (2016).
  11. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  12. Kaufmann, S. H. E., Gengenbacher, M. Recombinant live vaccine candidates against tuberculosis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (6), 900-907 (2012).
  13. Yuan, X., et al. A live attenuated BCG vaccine overexpressing multistage antigens Ag85B and HspX provides superior protection against Mycobacterium tuberculosis infection. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (24), 10587-10595 (2015).
  14. Vartak, A., Sucheck, S. J. Recent advances in subunit vaccine carriers. Vaccines. 4 (2), 12 (2016).
  15. Lindenstrøm, T., et al. Tuberculosis subunit vaccination provides long-term protective immunity characterized by multifunctional CD4 memory T cells1. The Journal of Immunology. 182 (12), 8047-8055 (2009).
  16. Liu, Y., et al. A subunit vaccine based on rH-NS induces protection against Mycobacterium tuberculosis infection by inducing the Th1 immune response and activating macrophages. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (10), 909-922 (2016).
  17. Ning, H., et al. Subunit vaccine ESAT-6:c-di-AMP delivered by intranasal route elicits immune responses and protects against Mycobacterium tuberculosis infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 647220 (2021).
  18. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
  19. Moyle, P. M., Toth, I. Modern subunit vaccines: development, components, and research opportunities. ChemMedChem. 8 (3), 360-376 (2013).
  20. Baxter, D. Active and passive immunity, vaccine types, excipients and licensing. Occupational Medicine. 57 (8), 552-556 (2007).
  21. Lee, W. -. H., et al. Vaccination with Klebsiella pneumoniae-derived extracellular vesicles protects against bacteria-induced lethality via both humoral and cellular immunity. Experimental & Molecular Medicine. 47 (9), e183-e183 (2015).
  22. Micoli, F., et al. Comparative immunogenicity and efficacy of equivalent outer membrane vesicle and glycoconjugate vaccines against nontyphoidal Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (41), 10428-10433 (2018).
  23. Obiero, C. W., et al. A phase 2a randomized study to evaluate the safety and immunogenicity of the 1790GAHB generalized modules for membrane antigen vaccine against Shigella sonnei administered intramuscularly to adults from a shigellosis-endemic country. Frontiers in Immunology. 8, 1884 (2017).
  24. Sedaghat, M., et al. Evaluation of antibody responses to outer membrane vesicles (OMVs) and killed whole cell of Vibrio cholerae O1 El Tor in immunized mice. Iranian Journal of Microbiology. 11 (3), 212-219 (2019).
  25. Adriani, R., Mousavi Gargari, S. L., Nazarian, S., Sarvary, S., Noroozi, N. Immunogenicity of Vibrio cholerae outer membrane vesicles secreted at various environmental conditions. Vaccine. 36 (2), 322-330 (2018).
  26. Roier, S., et al. Intranasal immunization with nontypeable Haemophilus influenzae outer membrane vesicles induces cross-protective immunity in mice. PLOS ONE. 7 (8), e42664 (2012).
  27. Furuyama, N., Sircili, M. P. Outer membrane vesicles (OMVs) produced by gram-negative bacteria: structure, functions, biogenesis, and vaccine application. BioMed Research International. 2021, e1490732 (2021).
  28. Buzas, E. I. The roles of extracellular vesicles in the immune system. Nature Reviews Immunology. 23 (4), 236-250 (2022).
  29. Cai, W., et al. Bacterial outer membrane vesicles, a potential vaccine candidate in interactions with host cells based. Diagnostic Pathology. 13 (1), 95 (2018).
  30. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
  31. Bai, X., Findlow, J., Borrow, R. Recombinant protein meningococcal serogroup B vaccine combined with outer membrane vesicles. Expert Opinion on Biological Therapy. 11 (7), 969-985 (2011).
  32. Nagaputra, J. C., et al. Neisseria meningitidis native outer membrane vesicles containing different lipopolysaccharide glycoforms as adjuvants for meningococcal and nonmeningococcal antigens. Clinical and Vaccine Immunology: CVI. 21 (2), 234-242 (2014).
  33. Echeverria-Valencia, G., Flores-Villalva, S., Espitia, C. I. Virulence factors and pathogenicity of Mycobacterium. Mycobacterium – Research and Development. IntechOpen. , (2017).
  34. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  35. Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
  36. Das, S., et al. Development of DNA aptamers to visualize release of mycobacterial membrane-derived extracellular vesicles in infected macrophages. Pharmaceuticals. 15 (1), 45 (2022).
  37. Brandt, L., Elhay, M., Rosenkrands, I., Lindblad, E. B., Andersen, P. ESAT-6 subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity. 68 (2), 791-795 (2000).
  38. Kim, W. S., Kim, H., Kwon, K. W., Cho, S. -. N., Shin, S. J. Immunogenicity and vaccine potential of InsB, an ESAT-6-like antigen identified in the highly virulent Mycobacterium tuberculosis Beijing K strain. Frontiers in Microbiology. 10, 220 (2019).
  39. Valizadeh, A., et al. Evaluating the performance of PPE44, HSPX, ESAT-6 and CFP-10 factors in tuberculosis subunit vaccines. Current Microbiology. 79 (9), 260 (2022).
  40. Tang, Y., et al. Cryo-EM structure of Mycobacterium smegmatis DyP-loaded encapsulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (16), (2021).
  41. Rosenkrands, I., et al. Identification and characterization of a 29-kilodalton protein from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate recognized by mouse memory effector cells. Infection and Immunity. 66 (6), 2728-2735 (1998).
  42. Gu, S., et al. Comprehensive proteomic profiling of the membrane constituents of a Mycobacterium tuberculosis strain. Molecular & cellular proteomics: MCP. 2 (12), 1284-1296 (2003).
  43. Xiong, Y., Chalmers, M. J., Gao, F. P., Cross, T. A., Marshall, A. G. Identification of Mycobacterium tuberculosis H37Rv integral membrane proteins by one-dimensional gel electrophoresis and liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 4 (3), 855-861 (2005).
  44. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. -. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  45. Klein, J. S., Jiang, S., Galimidi, R. P., Keeffe, J. R., Bjorkman, P. J. Design and characterization of structured protein linkers with differing flexibilities. Protein Engineering, Design and Selection. 27 (10), 325-330 (2014).
  46. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning, a laboratory manual, 4th Edition. , (2012).
  47. Atmakuri, K., Ding, Z., Christie, P. J. VirE2, a Type IV secretion substrate, interacts with the VirD4 transfer protein at cell poles of Agrobacterium tumefaciens. MolecularMicrobiology. 49 (6), 1699-1713 (2003).
  48. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
  49. Khademi, F., Derakhshan, M., Yousefi-Avarvand, A., Tafaghodi, M., Soleimanpour, S. Multi-stage subunit vaccines against Mycobacterium tuberculosis: an alternative to the BCG vaccine or a BCG-prime boost. Expert Review of Vaccines. 17 (1), 31-44 (2018).
  50. Prior, J. T., et al. Bacterial-derived outer membrane vesicles are potent adjuvants that drive humoral and cellular immune responses. Pharmaceutics. 13 (2), 131 (2021).
  51. Tan, K., Li, R., Huang, X., Liu, Q. Outer membrane vesicles: current status and future direction of these novel vaccine adjuvants. Frontiers in Microbiology. 9, 783 (2018).

Play Video

Cite This Article
Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K., Kumar, S., Sisodiya, L., Jain, S., Mahlawat, R., Sharma, N., Gupta, V., Atmakuri, K. Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. J. Vis. Exp. (202), e65138, doi:10.3791/65138 (2023).

View Video