Anreicherung nativer und rekombinanter extrazellulärer Vesikel von Mykobakterien

Trotz der Entwicklung und Verabreichung einer breiten Palette von Impfstoffen gegen Infektionskrankheiten ereignen sich auch heute noch ~30% aller Todesfälle beim Menschen durch übertragbare Krankheiten¹. Vor dem Aufkommen des Tuberkulose-Impfstoffs – Bacillus Calmette Guerin (BCG) – war Tuberkulose die häufigste Todesursache (~10.000 bis 15.000/100.000 Einwohner)². Mit der Verabreichung von BCG und dem einfachen Zugang zu Erst- und Zweitlinienmedikamenten gegen Tuberkulose sind die TB-bedingten Todesfälle bis 2022 dramatisch auf ~1 Million/Jahr bis 2022 gesunken (d. h. ~15-20/100.000 Einwohner¹). In den TB-endemischen Populationen der Welt liegt die Zahl der TB-bedingten Todesfälle jedoch weiterhin bei ~100-550/100.000 Einwohnern¹. Während Experten mehrere Gründe erkennen, die zu diesen verzerrten Zahlen führen, scheint der BCG-vermittelte Schutz, der nicht einmal im ersten Lebensjahrzehnt anhält, der Hauptgrund dafür zu sein 3,4,5,6,7. Angesichts der erneuerten “Ziele für nachhaltige Entwicklung” der Vereinten Nationen und der “Strategie zur Beendigung der Tuberkulose” der WHO gibt es daher konzertierte globale Anstrengungen, um eine viel bessere Impfstoffalternative zu BCG zu entwickeln, die möglicherweise einen lebenslangen Schutz vor Tuberkulose bietet.

Um dieses Ziel zu erreichen, evaluieren mehrere Gruppen derzeit modifizierte/rekombinante BCG-Stämme, nicht-pathogene und abgeschwächte Mykobakterienspezies außer BCG und Untereinheitenkandidaten 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Typischerweise handelt es sich bei Subunit-Impfstoffen um Liposomen, die selektiv mit wenigen gereinigten (~1-6) vollständigen (~1-6) immunogenen Proteinen des Erregers beladen sind. Aufgrund ihrer unechten Faltung in nicht-native Konformationen und/oder zufälliger nicht-funktionaler Interaktionen zwischen den beladenen Proteinen fehlen den Untereinheiten jedoch oft native und germane Epitope und sie können das Immunsystem daher nicht ausreichend vorbereiten^14,19,20.

Folglich haben extrazelluläre Vesikel (EVs) von Bakterien als vielversprechende Alternative an Fahrt aufgenommen 21,22,23,24,25,26. Typischerweise enthalten bakterielle EVs (bEVs) eine Teilmenge ihrer zellulären Bestandteile, darunter einige Teile von Nukleinsäuren, Lipiden und Hunderten von Metaboliten und Proteinen^27,28. Im Gegensatz zu Liposomen, bei denen einige wenige gereinigte Proteine künstlich geladen werden, enthalten bEVs Hunderte von natürlich beladenen, nativ gefalteten Proteinen mit einer besseren Neigung, das Immunsystem vorzubereiten, insbesondere ohne den Schub/die Hilfe von Adjuvantien und Toll-like-Rezeptoren (TLR)-Agonisten^27,28,29. In dieser Forschungsrichtung haben wir und andere den Nutzen von mykobakteriellen EVs als potenzielle Untereinheiten-Booster für BCG³⁰ untersucht. Trotz der Befürchtungen, dass bEVs keine einheitlichen Antigenlasten aufweisen, haben EVs aus abgeschwächter Neisseria meningitidis den Menschen erfolgreich vor Meningokokken der Serogruppe B geschützt^31,32.

Zumindest theoretisch sind die besten EVs, die BCG gut steigern könnten, die EVs, die mit pathogenen Bakterien angereichert sind. Die Anreicherung von Elektrofahrzeugen, die durch pathogene Mykobakterien erzeugt werden, ist jedoch teuer, zeitaufwändig und riskant. Darüber hinaus können durch Krankheitserreger erzeugte EVs virulenter als schützend sein. Angesichts der potenziellen Risiken berichten wir hier über ein gut getestetes Protokoll zur Anreicherung von Elektrofahrzeugen, die durch axenisch gezüchtetes MSM, ein avirulentes Mykobakterium, erzeugt werden.

Trotz der Kodierung mehrerer pathogener Proteinorthologe fehlen avirulenten Mykobakterien jedoch mehrere Impfantigene/pathogene Proteinepitope, die notwendig sind, um das Immunsystem ausreichend auf den Schutz vorzubereiten³³. Daher untersuchten wir auch die Konstruktion und Anreicherung rekombinanter EVs von Msm durch molekulares Engineering, so dass ein signifikanter Teil jedes pathogenen Proteins von Interesse, das in Msm exprimiert und translatiert wird, seine EVs erreichen muss. Wir stellten die Hypothese auf, dass eines oder mehrere der 10 am häufigsten vorkommenden Proteine von MSM EVs, wenn sie mit dem interessierenden Protein fusioniert werden, bei einer solchen Translokation helfen.

Während wir 2011 begannen, die Anreicherung von mykobakteriellen EVs (mEVs) in unserem Labor zu standardisieren, berichteten Prados-Rosales et al. erstmals über die Visualisierung und Anreicherung von mEVs in vitro³⁰. Später, im Jahr 2014, veröffentlichte dieselbe Gruppe eine modifizierte Version ihrer Methode³⁴ aus dem Jahr 2011. Im Jahr 2015 berichteten Lee et al. auch über eine unabhängig standardisierte Methode zur mEV-Anreicherung, wiederum aus axenischen Kulturen von Mykobakterien³⁵. Durch die Kombination beider Protokolle 34,35 und die Einbeziehung einiger unserer Modifikationen nach gründlicher Standardisierung beschreiben wir hier ein Protokoll^, das bei der routinemäßigen Anreicherung von mEVs aus axenischen Kulturen von Mykobakterien^{hilft 36}.

Hier gehen wir besonders auf die Anreicherung von MSM-spezifischen EVs ein, die eine Erweiterung eines veröffentlichten Protokolls³⁶ für die Anreicherung von mykobakteriellen EVs im Allgemeinen darstellt. Wir beschreiben auch, wie rekombinante mEVs (R-mEVs) konstruiert werden können, die das mCherry-Protein (als rot fluoreszierender Reporter) und EsxA (Esat-6)^37,38,39 enthalten, ein vorherrschendes Immunogen und eine potenzielle Untereinheit des Vaccinogens von Mycobacterium tuberculosis. Das Protokoll für die Anreicherung der R-mEVs bleibt identisch mit dem, das wir für die Anreicherung nativer EVs von MSM beschrieben haben.