Summary

マイコバクテリアの天然および組換え細胞外小胞の濃縮

Published: December 08, 2023
doi:

Summary

このプロトコルでは、マイコバクテリウム・スメグマティス(Msm)の軸種培養からの天然マイコバクテリア細胞外小胞(mEV)の濃縮と、mCherry(赤色蛍光レポーター)含有組換えMsmEVsの設計と濃縮方法について詳しく説明します。最後に、結核菌のEsxAタンパク質を含むMsmEVを濃縮することで、新しいアプローチを検証します。

Abstract

マイコバクテリアを含むほとんどの細菌は、細胞外小胞(EV)を生成します。細菌EV(bEV)には、代謝物、脂質、タンパク質、核酸などの細胞成分のサブセットが含まれているため、いくつかのグループが、サブユニットワクチン候補としての防御力について、bEVのネイティブバージョンまたは組換えバージョンのいずれかを評価しています。ネイティブEVとは異なり、組換えEVは、目的の免疫原を1つ以上含むように分子操作されています。過去10年間、さまざまなグループが組換え型bEVを生成するための多様なアプローチを模索してきました。しかし、ここでは、マイコバクテリアにおける組換えマイコバクテリアEV(mEV)の設計、構築、および濃縮について報告します。そのために、菌性土壌マイコバクテリウムである マイコバクテリウム・スメグマティス (Msm)をモデルシステムとして用いています。まず、MsmのネイティブEVの生成とエンリッチメントについて説明します。次に、赤色蛍光レポータータンパク質であるmCherry、または 結核菌の代表的な免疫原であるEsxA(Esat-6)のいずれかを含む組換えmEVの設計と構築について説明します。これは、mCherryとEsxAのN末端を、小さなMsmタンパク質Cfp-29のC末端と別々に融合させることで実現しています。 Cfp-29は、MsmEVに豊富に存在する数少ないタンパク質の1つです。Msm から組換え mEV を生成して濃縮するプロトコルは、Msm のネイティブ EV の生成と濃縮と同じままです。

Introduction

感染症に対する幅広いワクチンが開発・投与されているにもかかわらず、今日でも全死亡の~30%が伝染病によるものです1。結核(TB)ワクチンであるカルメット・ゲラン菌(BCG)が登場する前は、結核が死因の第1位でした(人口10万人あたり10,000~15,000人)2。BCGの投与と第一選択薬と第二選択薬の入手の容易さにより、2022年までに結核関連の死亡は劇的に減少し、2022年までに年間~100万人(すなわち、人口10万人あたり~15-20人)になりました1。しかし、世界の結核流行集団では、結核関連の死亡者数は人口10万人あたり100~550人にとどまっています1。専門家は、これらの数値の歪みにつながるいくつかの理由を認識していますが、BCGを介した保護が生後10年間も持続しないことが、3,4,5,6,7顕著な理由のようです。その結果、国連の「持続可能な開発目標」とWHOの「結核撲滅戦略」が新たに採択されたことから、BCGに代わる、結核を生涯にわたって防ぐことができる、はるかに優れたワクチンを開発するための世界的な取り組みが世界的に協力して行われています。

その目的に向けて、いくつかのグループが現在、修飾/組換えBCG株、BCG以外の非病原性および弱毒化マイコバクテリア種、およびサブユニット候補8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18を評価しています.典型的には、サブユニットワクチンは、病原体の精製された(~1-6)完全長または切断された免疫原性タンパク質を数個選択的にロードしたリポソームである。しかし、非天然のコンフォメーションへの偽の折り畳みや、ロードされたタンパク質間のランダムな非機能的相互作用のために、サブユニットはしばしば天然およびゲルマンエピトープを欠いており、したがって、免疫系を十分に呼び起こすことができません14,19,20。

その結果、細菌の細胞外小胞(EV)は、有望な代替手段としてペースを上げています21,22,23,24,25,26。典型的には、細菌のEV(bEV)には、核酸、脂質の一部、数百の代謝物やタンパク質など、細胞成分のサブセットが含まれています27,28。少数の精製タンパク質が人工的にロードされるリポソームとは異なり、bEVには、特にアジュバントやToll様受容体(TLR)アゴニストのブースト/補助なしに、免疫系をプライミングする傾向が優れた、自然にロードされたネイティブフォールドタンパク質が何百個も含まれています27,28,29。この研究ラインにおいて、私たちや他の研究者は、BCG30のサブユニットブースターとしてのマイコバクテリアEVの有用性を探ってきました。bEVは均一な抗原負荷を欠いているという懸念にもかかわらず、弱毒化髄炎菌由来のEVは、血清型B髄膜炎菌からヒトを保護することに成功しています31,32

少なくとも理論的には、BCGをうまく高めることができる最高のEVは、病原菌を豊富に含むEVです。しかし、病原性マイコバクテリウムによって生成されたEVを濃縮するには、費用と時間がかかり、リスクが伴います。さらに、病原体が生成するEVは、防御よりも毒性が強い可能性があります。潜在的なリスクを考慮して、ここでは、アキセンで増殖したマイコバクテリウムであるMsmによって生成されたEVを濃縮するための十分にテストされたプロトコルを報告します。

しかし、いくつかの病原体タンパク質オルソログをコードしているにもかかわらず、ウイルス性マイコバクテリアは、免疫系を防御に向けて十分にプライミングするために必要ないくつかのワクチン抗原/病原性タンパク質エピトープを欠いています33。そこで、分子工学を通じて、Msmで発現・翻訳された病原性タンパク質のかなりの部分がEVに到達するように、Msmの組換えEVを構築し、濃縮することも検討しました。我々は、Msm EVの上位10個の豊富なタンパク質のうちの1つ以上が、目的のタンパク質に融合すると、そのような転座を助けるという仮説を立てました。

2011年、Prados-Rosalesらは、マイコバクテリアEV(mEV)の濃縮を研究室で標準化し始めていましたが、in vitro30で初めてmEVの可視化と濃縮を報告しました。その後、2014年に同じグループが2011年のメソッド34の修正版を発表しました。2015年、Leeらは、マイコバクテリアの軸培養物からmEVを濃縮するための独立して標準化された方法も報告しました35。両方のプロトコル34,35を組み合わせ、徹底的な標準化の後にいくつかの変更を組み込んで、マイコバクテリア36の軸培養物からのmEVを日常的に濃縮するのに役立つプロトコルをここで説明します。

ここでは、マイコバクテリアEV全般の濃縮のために公開されているプロトコル36の拡張である、Msm特異的EVの濃縮について特に詳しく説明します。また、mCherryタンパク質(赤色蛍光レポーターとして)と、結核菌の主要な免疫原であり、サブユニットワクチンの候補であるEsxA(Esat-6)37,38,39を含む組換えmEV(R-mEV)の構築方法についても詳しく説明します。R-mEVを濃縮するためのプロトコルは、MsmのネイティブEVを濃縮するために説明したものと同じです。

Protocol

1. マイコバクテリウム・スメグマティス、 大腸菌およびその誘導体の生育条件 メディアミドルブルック7H9液体スープガラスビーカー内の必要量の二重蒸留水(ddw)を電子レンジで~45-50 °Cに予熱して20%Tween-80ストック溶液を調製し、適切なメスシリンダーを使用して必要量のTween-80を加え、小型のマグネチックスタ?…

Representative Results

我々は、 M. smegmatis (Msm) をモデルマイコバクテリウムとして使用し、天然および組換え mEV (R-mEV) の両方の濃縮を実証しました。この模式的にまとめたmEVエンリッチメントプロトコル(図1)は、MsmのR-mEVとMtbのネイティブEVのエンリッチメントにも有効です(プロトコルノート1.2のように若干の変更が加えられています)。濃縮されたmEVを可視化するには、透過型電子顕?…

Discussion

BCGよりも優れており、BCGに取って代わることができる新しい結核ワクチンの開発は依然として手ごわい課題であるため、代替案として、いくつかのグループは、BCGの効力を高め、その保護期間を延長できるさまざまなサブユニット結核ワクチンの発見を追求しています48,49。潜在的なサブユニットとして、また天然アジュバントとしての細菌EV(bEV)?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、 M. smegmatis mc2155 株を親切に共有してくださった Sarah M. Fortune 教授に心から感謝します。また、Servier Medical Art (smart.servier.com) が 図 1 にいくつかの基本要素を提供してくれたことも評価されています。彼らは、mEV濃縮のためのインキュベーターシェーカー、遠心分離機、超遠心分離機の長期使用中に忍耐強く調整してくれた他のラボメンバーのサポートに心から感謝しています。また、研究室助手のSurjeet Yadav氏には、必要なガラス器具や消耗品が常に手元にあることを常に確認していたことに感謝しています。最後に、THSTIの管理、購買、財務の各チームには、プロジェクトのシームレスな実行を継続的にサポートし、支援していただいたことに感謝しています。

Materials

A2 type Biosafety Cabinet Thermo Fisher Scientific, USA 1300 series
Bench top Centrifuge Eppendorf, USA 5810 R
BstB1, HindIII, HpaI NEB, USA NEB
Cell densitometer GE Healthcare, USA Ultraspec 10
Citric Acid Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Double Distilled Water Merck, USA ~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes Bio-Rad, USA 2 mm
Electroporator Bio-Rad, USA Electroporator
EsxA-specific Ab Abcam, UK Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Floor model centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA Sorvall RC6 plus
Glassware Borosil, INDIA 1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Incubator shakers Thermo Fisher Scientific, USA MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller Hi Media, INDIA Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Magnetic stirrer Tarsons, INDIA Tarsons
mCherry-specific Ab Abcam, UK Rabbit monoclonal
Microwave LG, INDIA MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth BD, USA Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment BD, USA BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, USA Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a NEB, USA a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol) Merck, USA Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit Hi Media, INDIA Hi Media
pH Meter Mettler Toledo, USA Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit Hi Media, INDIA Hi Media
Plate incubator Thermo Fisher Scientific, USA New Series
Plasmid pMV261 Addgene, USA *
*The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank
Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific, USA Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase NEB, USA NEB
Refrigerated circulating water bath Thermo Fisher Scientific, USA R20
Middlebrock 7H11 Agar base BD, USA BBL Seven H11 Agar base
SOC broth Hi Media, INDIA Hi Media
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase NEB, USA NEB
Tween-80 Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Ultracentrifuge Beckman Coulter, USA Optima L100K
Ultracentrifuge tubes – 14 mL Beckman Coulter, USA Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes – 38 mL Beckman Coulter, USA Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator Thermo Fisher Scientific, USA Sonicator – bench top model
0.22 µm Disposable filters Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators Merck, USA Amicon Ultra centrifugal filters – Millipore
3X FLAG antibody Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes Corning, USA Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli NEB, USA NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG This study MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm) Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA  MC2 155

References

  1. . Global Tuberculosis Report 2022. , (2022).
  2. Luca, S., Mihaescu, T. History of BCG vaccine. Mædica. 8 (1), 53-58 (2013).
  3. Palmer, C. E., Long, M. W. Effects of infection with atypical mycobacteria on BCG vaccination and tuberculosis. The American Review of Respiratory Disease. 94 (4), 553-568 (1966).
  4. Brandt, L., et al. Failure of the Mycobacterium bovis BCG vaccine: some species of environmental mycobacteria block multiplication of BCG and induction of protective immunity to tuberculosis. Infection and Immunity. 70 (2), 672-678 (2002).
  5. Andersen, P., Doherty, T. M. The success and failure of BCG – implications for a novel tuberculosis vaccine. Nature Reviews. Microbiology. 3 (8), 656-662 (2005).
  6. Kumar, P. A perspective on the success and failure of BCG. Frontiers in Immunology. 12, 778028 (2021).
  7. Fine, P. E. Variation in protection by BCG: implications of and for heterologous immunity. Lancet. 346 (8986), 1339-1345 (1995).
  8. Triccas, J. A. Recombinant BCG as a vaccine vehicle to protect against tuberculosis. Bioengineered Bugs. 1 (2), 110-115 (2010).
  9. Dietrich, G., Viret, J. -. F., Hess, J. Mycobacterium bovis BCG-based vaccines against tuberculosis: novel developments. Vaccine. 21 (7-8), 667-670 (2003).
  10. Singh, V. K., Srivastava, R., Srivastava, B. S. Manipulation of BCG vaccine: a double-edged sword. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (4), 535-543 (2016).
  11. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  12. Kaufmann, S. H. E., Gengenbacher, M. Recombinant live vaccine candidates against tuberculosis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (6), 900-907 (2012).
  13. Yuan, X., et al. A live attenuated BCG vaccine overexpressing multistage antigens Ag85B and HspX provides superior protection against Mycobacterium tuberculosis infection. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (24), 10587-10595 (2015).
  14. Vartak, A., Sucheck, S. J. Recent advances in subunit vaccine carriers. Vaccines. 4 (2), 12 (2016).
  15. Lindenstrøm, T., et al. Tuberculosis subunit vaccination provides long-term protective immunity characterized by multifunctional CD4 memory T cells1. The Journal of Immunology. 182 (12), 8047-8055 (2009).
  16. Liu, Y., et al. A subunit vaccine based on rH-NS induces protection against Mycobacterium tuberculosis infection by inducing the Th1 immune response and activating macrophages. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (10), 909-922 (2016).
  17. Ning, H., et al. Subunit vaccine ESAT-6:c-di-AMP delivered by intranasal route elicits immune responses and protects against Mycobacterium tuberculosis infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 647220 (2021).
  18. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
  19. Moyle, P. M., Toth, I. Modern subunit vaccines: development, components, and research opportunities. ChemMedChem. 8 (3), 360-376 (2013).
  20. Baxter, D. Active and passive immunity, vaccine types, excipients and licensing. Occupational Medicine. 57 (8), 552-556 (2007).
  21. Lee, W. -. H., et al. Vaccination with Klebsiella pneumoniae-derived extracellular vesicles protects against bacteria-induced lethality via both humoral and cellular immunity. Experimental & Molecular Medicine. 47 (9), e183-e183 (2015).
  22. Micoli, F., et al. Comparative immunogenicity and efficacy of equivalent outer membrane vesicle and glycoconjugate vaccines against nontyphoidal Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (41), 10428-10433 (2018).
  23. Obiero, C. W., et al. A phase 2a randomized study to evaluate the safety and immunogenicity of the 1790GAHB generalized modules for membrane antigen vaccine against Shigella sonnei administered intramuscularly to adults from a shigellosis-endemic country. Frontiers in Immunology. 8, 1884 (2017).
  24. Sedaghat, M., et al. Evaluation of antibody responses to outer membrane vesicles (OMVs) and killed whole cell of Vibrio cholerae O1 El Tor in immunized mice. Iranian Journal of Microbiology. 11 (3), 212-219 (2019).
  25. Adriani, R., Mousavi Gargari, S. L., Nazarian, S., Sarvary, S., Noroozi, N. Immunogenicity of Vibrio cholerae outer membrane vesicles secreted at various environmental conditions. Vaccine. 36 (2), 322-330 (2018).
  26. Roier, S., et al. Intranasal immunization with nontypeable Haemophilus influenzae outer membrane vesicles induces cross-protective immunity in mice. PLOS ONE. 7 (8), e42664 (2012).
  27. Furuyama, N., Sircili, M. P. Outer membrane vesicles (OMVs) produced by gram-negative bacteria: structure, functions, biogenesis, and vaccine application. BioMed Research International. 2021, e1490732 (2021).
  28. Buzas, E. I. The roles of extracellular vesicles in the immune system. Nature Reviews Immunology. 23 (4), 236-250 (2022).
  29. Cai, W., et al. Bacterial outer membrane vesicles, a potential vaccine candidate in interactions with host cells based. Diagnostic Pathology. 13 (1), 95 (2018).
  30. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
  31. Bai, X., Findlow, J., Borrow, R. Recombinant protein meningococcal serogroup B vaccine combined with outer membrane vesicles. Expert Opinion on Biological Therapy. 11 (7), 969-985 (2011).
  32. Nagaputra, J. C., et al. Neisseria meningitidis native outer membrane vesicles containing different lipopolysaccharide glycoforms as adjuvants for meningococcal and nonmeningococcal antigens. Clinical and Vaccine Immunology: CVI. 21 (2), 234-242 (2014).
  33. Echeverria-Valencia, G., Flores-Villalva, S., Espitia, C. I. Virulence factors and pathogenicity of Mycobacterium. Mycobacterium – Research and Development. IntechOpen. , (2017).
  34. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  35. Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
  36. Das, S., et al. Development of DNA aptamers to visualize release of mycobacterial membrane-derived extracellular vesicles in infected macrophages. Pharmaceuticals. 15 (1), 45 (2022).
  37. Brandt, L., Elhay, M., Rosenkrands, I., Lindblad, E. B., Andersen, P. ESAT-6 subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity. 68 (2), 791-795 (2000).
  38. Kim, W. S., Kim, H., Kwon, K. W., Cho, S. -. N., Shin, S. J. Immunogenicity and vaccine potential of InsB, an ESAT-6-like antigen identified in the highly virulent Mycobacterium tuberculosis Beijing K strain. Frontiers in Microbiology. 10, 220 (2019).
  39. Valizadeh, A., et al. Evaluating the performance of PPE44, HSPX, ESAT-6 and CFP-10 factors in tuberculosis subunit vaccines. Current Microbiology. 79 (9), 260 (2022).
  40. Tang, Y., et al. Cryo-EM structure of Mycobacterium smegmatis DyP-loaded encapsulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (16), (2021).
  41. Rosenkrands, I., et al. Identification and characterization of a 29-kilodalton protein from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate recognized by mouse memory effector cells. Infection and Immunity. 66 (6), 2728-2735 (1998).
  42. Gu, S., et al. Comprehensive proteomic profiling of the membrane constituents of a Mycobacterium tuberculosis strain. Molecular & cellular proteomics: MCP. 2 (12), 1284-1296 (2003).
  43. Xiong, Y., Chalmers, M. J., Gao, F. P., Cross, T. A., Marshall, A. G. Identification of Mycobacterium tuberculosis H37Rv integral membrane proteins by one-dimensional gel electrophoresis and liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 4 (3), 855-861 (2005).
  44. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. -. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  45. Klein, J. S., Jiang, S., Galimidi, R. P., Keeffe, J. R., Bjorkman, P. J. Design and characterization of structured protein linkers with differing flexibilities. Protein Engineering, Design and Selection. 27 (10), 325-330 (2014).
  46. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning, a laboratory manual, 4th Edition. , (2012).
  47. Atmakuri, K., Ding, Z., Christie, P. J. VirE2, a Type IV secretion substrate, interacts with the VirD4 transfer protein at cell poles of Agrobacterium tumefaciens. MolecularMicrobiology. 49 (6), 1699-1713 (2003).
  48. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
  49. Khademi, F., Derakhshan, M., Yousefi-Avarvand, A., Tafaghodi, M., Soleimanpour, S. Multi-stage subunit vaccines against Mycobacterium tuberculosis: an alternative to the BCG vaccine or a BCG-prime boost. Expert Review of Vaccines. 17 (1), 31-44 (2018).
  50. Prior, J. T., et al. Bacterial-derived outer membrane vesicles are potent adjuvants that drive humoral and cellular immune responses. Pharmaceutics. 13 (2), 131 (2021).
  51. Tan, K., Li, R., Huang, X., Liu, Q. Outer membrane vesicles: current status and future direction of these novel vaccine adjuvants. Frontiers in Microbiology. 9, 783 (2018).

Play Video

Cite This Article
Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K., Kumar, S., Sisodiya, L., Jain, S., Mahlawat, R., Sharma, N., Gupta, V., Atmakuri, K. Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. J. Vis. Exp. (202), e65138, doi:10.3791/65138 (2023).

View Video