Summary

Обогащение нативных и рекомбинантных внеклеточных везикул микобактерий

Published: December 08, 2023
doi:

Summary

В этом протоколе подробно описывается обогащение нативных микобактериальных внеклеточных везикул (mEV) из аксенических культур Mycobacterium smegmatis (Msm) и то, как можно спроектировать и обогатить mCherry (красный флуоресцентный репортер), содержащие рекомбинантные MsmEV. Наконец, он подтверждает новый подход с обогащением MsmEV, содержащих белок EsxA Mycobacterium tuberculosis.

Abstract

Большинство бактерий, включая микобактерии, продуцируют внеклеточные везикулы (ВВ). Поскольку бактериальные ВВ (бВВ) содержат подмножество клеточных компонентов, включая метаболиты, липиды, белки и нуклеиновые кислоты, несколько групп оценили либо нативные, либо рекомбинантные версии ВВ на предмет их защитной активности в качестве субъединичных вакцин-кандидатов. В отличие от нативных ВВ, рекомбинантные ВВ имеют молекулярную инженерию, содержащую один или несколько интересующих иммуногенов. За последнее десятилетие различные группы исследовали различные подходы к созданию рекомбинантных электромобилей. Однако здесь мы сообщаем о разработке, конструировании и обогащении рекомбинантных микобактериальных ВВ (мВВ) в микобактериях. Для этого в качестве модельной системы мы используем Mycobacterium smegmatis (Msm), авирулентную почвенную микобактерию. Сначала мы опишем генерацию и обогащение нативных электромобилей Msm. Затем мы описываем дизайн и конструкцию рекомбинантных mEV, которые содержат либо mCherry, красный флуоресцентный репортерный белок, либо EsxA (Esat-6), известный иммуноген Mycobacterium tuberculosis. Мы достигаем этого путем раздельного слияния mCherry и EsxA N-концов с С-концом небольшого белка Msm Cfp-29. Cfp-29 является одним из немногих белков, присутствующих в изобилии в MsmEV. Протокол генерации и обогащения рекомбинантных mEV из Msm остается идентичным протоколу генерации и обогащения нативных EV Msm.

Introduction

Несмотря на разработку и применение широкого спектра вакцин против инфекционных болезней, даже по сей день ~30% всех случаев смерти людей по-прежнему происходит от инфекционныхболезней1. До появления вакцины против туберкулеза (ТБ) – Bacillus Calmette Guerin (БЦЖ) – туберкулез был убийцей номер один (от ~10 000 до 15 000 на 100 000 населения)2. Благодаря введению БЦЖ и легкому доступу к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии к 2022 г. смертность, связанная с туберкулезом, резко снизилась до ~1 млн/год к 2022 г. (т.е. ~15-20 на 100 000населения1). Тем не менее, в эндемичных по туберкулезу популяциях мира смертность, связанная с туберкулезом, по-прежнему составляет ~100-550 на 100 000населения1. В то время как эксперты признают несколько причин, приводящих к таким искаженным цифрам, опосредованная БЦЖ защита, не сохраняющаяся даже в течение первого десятилетия жизни, по-видимому, является основной причиной 3,4,5,6,7. Таким образом, с учетом обновленных «Целей в области устойчивого развития» ООН и «Стратегии ВОЗ по ликвидации туберкулеза» предпринимаются согласованные глобальные усилия по разработке гораздо более совершенной альтернативы БЦЖ, которая, возможно, обеспечит пожизненную защиту от туберкулеза.

Для достижения этой цели несколько групп в настоящее время оценивают модифицированные/рекомбинантные штаммы БЦЖ, непатогенные и аттенуированные виды микобактерий, отличные от БЦЖ, и субъединичные кандидаты 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Как правило, субъединичные вакцины представляют собой липосомы, селективно нагруженные небольшим количеством очищенных (~1-6) полноразмерных или укороченных иммуногенных белков патогена. Тем не менее, из-за их ложного сворачивания в ненативные конформации и/или случайных нефункциональных взаимодействий между загруженными белками, субъединицы часто не имеют нативных и германных эпитопов и, следовательно, не могут в достаточной степени подготовить иммунную систему14,19,20.

Следовательно, внеклеточные везикулы (ВВ) бактерий набрали обороты в качестве многообещающей альтернативы 21,22,23,24,25,26. Как правило, бактериальные ВВ (бВВ) содержат подмножество своих клеточных компонентов, включая некоторые части нуклеиновых кислот, липидов и сотни метаболитов и белков27,28. В отличие от липосом, в которых несколько очищенных белков искусственно загружены, бэв содержат сотни естественно загруженных, нативно свернутых белков с большей склонностью к подготовке иммунной системы, особенно без усиления/помощи адъювантов и агонистов толл-подобных рецепторов (TLR)27,28,29. Именно в рамках этого направления исследований мы и другие изучили полезность микобактериальных EV в качестве потенциальных субъединичных бустеров BCG30. Несмотря на опасения по поводу того, что у бэв отсутствует однородная антигенная нагрузка, ВВ аттенуированной Neisseria meningitidis успешно защищают людей от менингококка серогруппы В31,32.

По крайней мере, теоретически, лучшими ВВ, которые могут хорошо повысить БЦЖ, являются ВВ, обогащенные патогенными бактериями. Однако обогащение электромобилей, генерируемых патогенными микобактериями, является дорогостоящим, трудоемким и рискованным процессом. Кроме того, электромобили, генерируемые патогенами, могут быть более вирулентными, чем защитными. Учитывая потенциальные риски, здесь мы сообщаем о хорошо протестированном протоколе обогащения электромобилей, генерируемых аксенически выращенной МСМ, авирулентной микобактерией.

Однако, несмотря на то, что авирулентные микобактерии кодируют несколько ортологов патогенных белков, им не хватает нескольких вакцинных антигенов/эпитопов патогенных белков, необходимых для того, чтобы в достаточной степени подготовить иммунную системук защите. Поэтому мы также исследовали создание и обогащение рекомбинантных ВВ МСМ с помощью молекулярной инженерии, таким образом, чтобы значительная часть любого патогенного белка, представляющего интерес, экспрессируемого и транслируемого в МСМ, должна достигать своих ВВ. Мы предположили, что один или несколько из 10 наиболее распространенных белков МСМ ВВ при слиянии с интересующим белком будут способствовать такой транслокации.

В 2011 году, когда мы начали стандартизировать обогащение микобактериальных ВВ (мВВ) в нашей лаборатории, Прадос-Росалес и др. впервые сообщили о визуализации и обогащении МЭВ in vitro30. Позже, в 2014 году, та же группа опубликовала модифицированную версию своего метода34 2011 года. В 2015 году Lee et al. также сообщили о независимом стандартизированном методе обогащения mEV из аксенических культур микобактерий35. Объединив оба протокола 34,35 и включив некоторые из наших модификаций после тщательной стандартизации, мы описываем здесь протокол, который помогает регулярно обогащать mEV из аксенических культур микобактерий36.

Здесь мы особенно подробно остановимся на обогащении ВВ, специфичных для МСМ, которое является расширением опубликованного протокола36 для обогащения ВВ микобактерий в целом. Мы также подробно описываем, как конструировать рекомбинантные mEV (R-mEV), которые содержат белок mCherry (в виде красного флуоресцентного репортера) и EsxA (Esat-6)37,38,39, преобладающий иммуноген и потенциальный субъединица вакциногена Mycobacterium tuberculosis. Протокол обогащения R-mEV остается идентичным тому, который мы описали для обогащения нативных электромобилей от Msm.

Protocol

1. Условия произрастания Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli и их производных МедиаМиддлбрук 7H9 жидкий бульонПриготовьте 20% исходный раствор Tween-80, предварительно нагрев необходимый объем воды двойной дистилляции (ddw) в стеклянном стакане до ~45-50 …

Representative Results

Мы используем M. smegmatis (Msm) в качестве модельной микобактерии, чтобы продемонстрировать обогащение как нативных, так и рекомбинантных mEV (R-mEV). Этот схематически обобщенный протокол обогащения mEVs (рис. 1) также работает для обогащения R-mEV Msm и собственных EV Mtb (с незначительными изменени?…

Discussion

Поскольку разработка новой противотуберкулезной вакцины, превосходящей БЦЖ и способной заменить ее, остается серьезной проблемой в качестве альтернативы, несколько групп работают над открытием различных субъединичных противотуберкулезных вакцин, которые могут повысить эффективно?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы искренне благодарят профессора Сару М. Форчун (Sarah M. Fortune) за любезное предоставление материала M. smegmatis mc2155. Они также выражают признательность компании «Сервье Медикал Арт» (smart.servier.com) за предоставление некоторых основных элементов для рисунка 1. Они искренне признательны остальным сотрудникам лаборатории за поддержку их пациентов во время длительного использования шейкеров инкубатора, центрифуг и ультрацентрифуг для обогащения mEV. Они также выражают признательность г-ну Сурджиту Ядаву, лаборанту, за то, что он всегда следил за тем, чтобы необходимая стеклянная посуда и расходные материалы всегда были под рукой. Наконец, они выражают признательность административной, закупочной и финансовой командам THSTI за их постоянную поддержку и помощь в бесперебойной реализации проекта.

Materials

A2 type Biosafety Cabinet Thermo Fisher Scientific, USA 1300 series
Bench top Centrifuge Eppendorf, USA 5810 R
BstB1, HindIII, HpaI NEB, USA NEB
Cell densitometer GE Healthcare, USA Ultraspec 10
Citric Acid Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Double Distilled Water Merck, USA ~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes Bio-Rad, USA 2 mm
Electroporator Bio-Rad, USA Electroporator
EsxA-specific Ab Abcam, UK Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Floor model centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA Sorvall RC6 plus
Glassware Borosil, INDIA 1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Incubator shakers Thermo Fisher Scientific, USA MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller Hi Media, INDIA Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Magnetic stirrer Tarsons, INDIA Tarsons
mCherry-specific Ab Abcam, UK Rabbit monoclonal
Microwave LG, INDIA MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth BD, USA Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment BD, USA BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, USA Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a NEB, USA a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol) Merck, USA Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit Hi Media, INDIA Hi Media
pH Meter Mettler Toledo, USA Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit Hi Media, INDIA Hi Media
Plate incubator Thermo Fisher Scientific, USA New Series
Plasmid pMV261 Addgene, USA *
*The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank
Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific, USA Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase NEB, USA NEB
Refrigerated circulating water bath Thermo Fisher Scientific, USA R20
Middlebrock 7H11 Agar base BD, USA BBL Seven H11 Agar base
SOC broth Hi Media, INDIA Hi Media
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase NEB, USA NEB
Tween-80 Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Ultracentrifuge Beckman Coulter, USA Optima L100K
Ultracentrifuge tubes – 14 mL Beckman Coulter, USA Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes – 38 mL Beckman Coulter, USA Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator Thermo Fisher Scientific, USA Sonicator – bench top model
0.22 µm Disposable filters Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators Merck, USA Amicon Ultra centrifugal filters – Millipore
3X FLAG antibody Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes Corning, USA Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli NEB, USA NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG This study MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm) Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA  MC2 155

References

  1. . Global Tuberculosis Report 2022. , (2022).
  2. Luca, S., Mihaescu, T. History of BCG vaccine. Mædica. 8 (1), 53-58 (2013).
  3. Palmer, C. E., Long, M. W. Effects of infection with atypical mycobacteria on BCG vaccination and tuberculosis. The American Review of Respiratory Disease. 94 (4), 553-568 (1966).
  4. Brandt, L., et al. Failure of the Mycobacterium bovis BCG vaccine: some species of environmental mycobacteria block multiplication of BCG and induction of protective immunity to tuberculosis. Infection and Immunity. 70 (2), 672-678 (2002).
  5. Andersen, P., Doherty, T. M. The success and failure of BCG – implications for a novel tuberculosis vaccine. Nature Reviews. Microbiology. 3 (8), 656-662 (2005).
  6. Kumar, P. A perspective on the success and failure of BCG. Frontiers in Immunology. 12, 778028 (2021).
  7. Fine, P. E. Variation in protection by BCG: implications of and for heterologous immunity. Lancet. 346 (8986), 1339-1345 (1995).
  8. Triccas, J. A. Recombinant BCG as a vaccine vehicle to protect against tuberculosis. Bioengineered Bugs. 1 (2), 110-115 (2010).
  9. Dietrich, G., Viret, J. -. F., Hess, J. Mycobacterium bovis BCG-based vaccines against tuberculosis: novel developments. Vaccine. 21 (7-8), 667-670 (2003).
  10. Singh, V. K., Srivastava, R., Srivastava, B. S. Manipulation of BCG vaccine: a double-edged sword. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (4), 535-543 (2016).
  11. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  12. Kaufmann, S. H. E., Gengenbacher, M. Recombinant live vaccine candidates against tuberculosis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (6), 900-907 (2012).
  13. Yuan, X., et al. A live attenuated BCG vaccine overexpressing multistage antigens Ag85B and HspX provides superior protection against Mycobacterium tuberculosis infection. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (24), 10587-10595 (2015).
  14. Vartak, A., Sucheck, S. J. Recent advances in subunit vaccine carriers. Vaccines. 4 (2), 12 (2016).
  15. Lindenstrøm, T., et al. Tuberculosis subunit vaccination provides long-term protective immunity characterized by multifunctional CD4 memory T cells1. The Journal of Immunology. 182 (12), 8047-8055 (2009).
  16. Liu, Y., et al. A subunit vaccine based on rH-NS induces protection against Mycobacterium tuberculosis infection by inducing the Th1 immune response and activating macrophages. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (10), 909-922 (2016).
  17. Ning, H., et al. Subunit vaccine ESAT-6:c-di-AMP delivered by intranasal route elicits immune responses and protects against Mycobacterium tuberculosis infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 647220 (2021).
  18. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
  19. Moyle, P. M., Toth, I. Modern subunit vaccines: development, components, and research opportunities. ChemMedChem. 8 (3), 360-376 (2013).
  20. Baxter, D. Active and passive immunity, vaccine types, excipients and licensing. Occupational Medicine. 57 (8), 552-556 (2007).
  21. Lee, W. -. H., et al. Vaccination with Klebsiella pneumoniae-derived extracellular vesicles protects against bacteria-induced lethality via both humoral and cellular immunity. Experimental & Molecular Medicine. 47 (9), e183-e183 (2015).
  22. Micoli, F., et al. Comparative immunogenicity and efficacy of equivalent outer membrane vesicle and glycoconjugate vaccines against nontyphoidal Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (41), 10428-10433 (2018).
  23. Obiero, C. W., et al. A phase 2a randomized study to evaluate the safety and immunogenicity of the 1790GAHB generalized modules for membrane antigen vaccine against Shigella sonnei administered intramuscularly to adults from a shigellosis-endemic country. Frontiers in Immunology. 8, 1884 (2017).
  24. Sedaghat, M., et al. Evaluation of antibody responses to outer membrane vesicles (OMVs) and killed whole cell of Vibrio cholerae O1 El Tor in immunized mice. Iranian Journal of Microbiology. 11 (3), 212-219 (2019).
  25. Adriani, R., Mousavi Gargari, S. L., Nazarian, S., Sarvary, S., Noroozi, N. Immunogenicity of Vibrio cholerae outer membrane vesicles secreted at various environmental conditions. Vaccine. 36 (2), 322-330 (2018).
  26. Roier, S., et al. Intranasal immunization with nontypeable Haemophilus influenzae outer membrane vesicles induces cross-protective immunity in mice. PLOS ONE. 7 (8), e42664 (2012).
  27. Furuyama, N., Sircili, M. P. Outer membrane vesicles (OMVs) produced by gram-negative bacteria: structure, functions, biogenesis, and vaccine application. BioMed Research International. 2021, e1490732 (2021).
  28. Buzas, E. I. The roles of extracellular vesicles in the immune system. Nature Reviews Immunology. 23 (4), 236-250 (2022).
  29. Cai, W., et al. Bacterial outer membrane vesicles, a potential vaccine candidate in interactions with host cells based. Diagnostic Pathology. 13 (1), 95 (2018).
  30. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
  31. Bai, X., Findlow, J., Borrow, R. Recombinant protein meningococcal serogroup B vaccine combined with outer membrane vesicles. Expert Opinion on Biological Therapy. 11 (7), 969-985 (2011).
  32. Nagaputra, J. C., et al. Neisseria meningitidis native outer membrane vesicles containing different lipopolysaccharide glycoforms as adjuvants for meningococcal and nonmeningococcal antigens. Clinical and Vaccine Immunology: CVI. 21 (2), 234-242 (2014).
  33. Echeverria-Valencia, G., Flores-Villalva, S., Espitia, C. I. Virulence factors and pathogenicity of Mycobacterium. Mycobacterium – Research and Development. IntechOpen. , (2017).
  34. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  35. Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
  36. Das, S., et al. Development of DNA aptamers to visualize release of mycobacterial membrane-derived extracellular vesicles in infected macrophages. Pharmaceuticals. 15 (1), 45 (2022).
  37. Brandt, L., Elhay, M., Rosenkrands, I., Lindblad, E. B., Andersen, P. ESAT-6 subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity. 68 (2), 791-795 (2000).
  38. Kim, W. S., Kim, H., Kwon, K. W., Cho, S. -. N., Shin, S. J. Immunogenicity and vaccine potential of InsB, an ESAT-6-like antigen identified in the highly virulent Mycobacterium tuberculosis Beijing K strain. Frontiers in Microbiology. 10, 220 (2019).
  39. Valizadeh, A., et al. Evaluating the performance of PPE44, HSPX, ESAT-6 and CFP-10 factors in tuberculosis subunit vaccines. Current Microbiology. 79 (9), 260 (2022).
  40. Tang, Y., et al. Cryo-EM structure of Mycobacterium smegmatis DyP-loaded encapsulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (16), (2021).
  41. Rosenkrands, I., et al. Identification and characterization of a 29-kilodalton protein from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate recognized by mouse memory effector cells. Infection and Immunity. 66 (6), 2728-2735 (1998).
  42. Gu, S., et al. Comprehensive proteomic profiling of the membrane constituents of a Mycobacterium tuberculosis strain. Molecular & cellular proteomics: MCP. 2 (12), 1284-1296 (2003).
  43. Xiong, Y., Chalmers, M. J., Gao, F. P., Cross, T. A., Marshall, A. G. Identification of Mycobacterium tuberculosis H37Rv integral membrane proteins by one-dimensional gel electrophoresis and liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 4 (3), 855-861 (2005).
  44. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. -. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  45. Klein, J. S., Jiang, S., Galimidi, R. P., Keeffe, J. R., Bjorkman, P. J. Design and characterization of structured protein linkers with differing flexibilities. Protein Engineering, Design and Selection. 27 (10), 325-330 (2014).
  46. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning, a laboratory manual, 4th Edition. , (2012).
  47. Atmakuri, K., Ding, Z., Christie, P. J. VirE2, a Type IV secretion substrate, interacts with the VirD4 transfer protein at cell poles of Agrobacterium tumefaciens. MolecularMicrobiology. 49 (6), 1699-1713 (2003).
  48. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
  49. Khademi, F., Derakhshan, M., Yousefi-Avarvand, A., Tafaghodi, M., Soleimanpour, S. Multi-stage subunit vaccines against Mycobacterium tuberculosis: an alternative to the BCG vaccine or a BCG-prime boost. Expert Review of Vaccines. 17 (1), 31-44 (2018).
  50. Prior, J. T., et al. Bacterial-derived outer membrane vesicles are potent adjuvants that drive humoral and cellular immune responses. Pharmaceutics. 13 (2), 131 (2021).
  51. Tan, K., Li, R., Huang, X., Liu, Q. Outer membrane vesicles: current status and future direction of these novel vaccine adjuvants. Frontiers in Microbiology. 9, 783 (2018).

Play Video

Cite This Article
Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K., Kumar, S., Sisodiya, L., Jain, S., Mahlawat, R., Sharma, N., Gupta, V., Atmakuri, K. Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. J. Vis. Exp. (202), e65138, doi:10.3791/65138 (2023).

View Video