在这里,我们提出了一种通用方法,用于确定使用模式生物秀 丽隐杆线虫产生的胚胎活力和产生的胚胎总数(育雏)。
秀丽隐杆线虫 是研究减数分裂、受精和胚胎发育的优秀模式生物。 秀丽隐杆线虫 作为自受精雌雄同体存在,产生大量的后代——当雄性存在时,它们可以产生更大的杂交后代。减数分裂、受精和胚胎发生的错误可以快速评估为不育、生育能力降低或胚胎致死的表型。本文介绍了一种确定 秀丽隐杆线虫胚胎活力和育雏大小的方法。我们演示了如何通过在单个改良的Youngren’s,仅杆菌蛋白胨(MYOB)平板上挑选蠕虫来设置该测定,建立适当的时间范围来计数活的后代和不可存活的胚胎,并解释如何准确计数活蠕虫标本。该技术可用于确定自受精雌雄同体的生存能力以及交配对的交叉受精。这些相对简单的实验很容易被新研究人员采用,例如本科生和一年级研究生。
真核生物的有性生殖需要产生功能性配子,这些配子通过受精过程合并形成胚胎。母系和父系配子、卵子(卵子)和精子是通过减数分裂和配子发生的特殊细胞分裂和分化过程产生的1.减数分裂从单个二倍体细胞开始,以子细胞的形成结束,子细胞的染色体数量是原始亲本细胞的一半。从倍性的减少到通过独立分类和交叉重组 对 遗传物质进行洗牌,减数分裂具有多种重要功能1。减数分裂中的错误可导致非整倍性,其中配子内的染色体过多或过少。非整倍体的发病率对人类健康有巨大影响,因为染色体失衡是流产和发育障碍(如唐氏综合症和爱德华兹综合症)的主要原因2。
受精是母系和父系配子融合产生新生物体的过程3.配子-配子识别由配子表面的蛋白质促进3.配子相容性错误导致不育,因为精子和卵子融合无法进行。精子与卵母细胞的融合触发了许多事件,导致活性胚胎的适当形成,该胚胎可以通过有丝分裂 开始 从单细胞胚胎到功能齐全的多细胞生物的发育之旅4。在整个胚胎发生过程中,调节发育的分子事件必须受到严格调节和精确计时,以使生物体正常生长5。在早期发育过程中适当的细胞分化至关重要,因为生物体从多能胚胎过渡到成熟的生物体。由于这些事件的复杂性,中断可能导致发育缺陷,从而导致胚胎致死。
秀丽隐杆线虫 是研究减数分裂、受精和胚胎发育的优秀模式生物。 秀丽隐杆线 虫是一种透明的线虫,有两种性别,雄性和雌雄同体。 秀丽隐杆线虫 雌雄同体能够自我受精,是主要性别6,7。雌雄同体性腺首先在第四幼虫(L4)阶段产生精子,这些精子储存在精子中。在L4到成年期的过渡期,生殖系切换到产生卵母细胞,然后通过储存的精子 受 精。雄性以低于0.2%的速度出现在雌雄同体中,只产生精子并且可以与雌雄同体交配。在交叉受精后,雄性精子在卵母细胞受精中胜过雌雄同体精子8。这允许通过自育种来相对容易地维持纯合突变体,并通过遗传杂交进行遗传操作。这两种性别允许研究探索雄性和雌性生殖系减数分裂之间的差异。此外,由于 秀丽隐杆线虫 及其卵的透明性质, 可以使用荧光成像技术在活的、完整的动物中研究减数分裂、配子发生、受精和胚胎发生的过程。
在分析可能在 秀丽隐杆线虫减数分裂、受精和/或胚胎发育中起作用的基因新突变时,关键的第一步是确定胚胎活力和育雏大小,因为这些过程中的错误通常会导致存活后代的产生失败或减少。本文描述了一种评估自受精雌雄同体或雌雄同体杂交的生育能力、胚胎活力和育雏大小的方案。虽然这种经典的检测方法已用于许多 秀丽隐杆线虫 研究,但我们提供了用于设置和准确定量的标准化方案。在该协议中,分离单个蠕虫或雄性/雌雄同体对以允许交配和后代产生。在一系列天内观察后代的产生和活力,以确定可存活的后代和不可存活胚胎的数量。在实验结束时,分析单个育雏以计算胚胎活力百分比和总育雏大小。
有性繁殖物种的繁殖需要通过减数分裂形成单倍体配子(即卵子和精子),然后在受精时统一,恢复二倍体染色体数并启动胚胎发育。任何这些过程中的错误都可能导致不孕症、胚胎致死率和/或出生缺陷。秀丽隐杆线虫是研究有性生殖的强大模型系统。使用上述胚胎活力和育雏大小测定可以相对快速和容易地评估基因突变或基因表达敲低(例如,RNA干扰)的影响。我们已经使用这些方法对参与减数分裂染色体分离和受精/卵子活化的基因进行了初步表征10,11,12。观察到的胚胎活力或育雏大小的降低表明减数分裂、配子发生、受精或胚胎发生受到破坏。
由于通过计算后代和简单的数学计算相对容易地评估胚胎活力和育雏大小,因此这些是实验室或课堂上研究新手的最佳入门实验。 秀丽隐杆线虫 饲养的便利性和经济优势使它们特别适合实验生物学课程。学生通过秀 丽隐杆线虫 饲养获得宝贵的研究经验,学习使用解剖显微镜,并且可以在发育系统中提出生物学问题,这些问题可以在相对较短的时间内回答(本文描述的方案大约5天)。
后代计数的时间对于胚胎活力测定非常重要。在20°C下,胚胎发生大约需要16小时,生殖成熟的成虫在孵化为L1幼虫后约60小时开始产卵。由于生命周期很快,重要的是在适当的窗口内计算后代,让胚胎有足够的时间孵化,但在后代自己开始产卵之前。同样重要的是要注意,生长期因温度而异。24-25 °C 下的生长速度比 15-16 °C 快约 2.1 倍,20 °C 下的生长速度比 15-16 °C 快约 1.3 倍13。在该方案中,我们建议在将成虫放在新鲜盘子上48小时后进行计数。这个时间范围确保所有具有野生型发育的胚胎都有足够的时间孵化(>16小时),但不会衰老到繁殖能力的程度。在低于20°C的温度下进行的测定可能需要延长(转移动物4天),以使胚胎孵化和孵化的后代达到在MYOB板上的细菌中更容易观察到的幼虫阶段(L3-L4阶段)。
胚胎活力测定和育雏大小的局限性在于,受到干扰的特定发育过程并不明显。然而,这些初始测定可以用细胞学技术跟进,以确定哪个过程受到影响。例如,解剖成虫以释放性腺,然后进行4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色,并仔细分析种系内的DNA形态,可以揭示减数分裂过程是否被破坏。此外,胚胎的DAPI染色可以揭示胚胎发生停滞的哪个阶段。
总之,我们已经描述了一种方案,用于测定产生的胚胎数量(育雏)和对各种 秀丽隐杆线虫 突变体可行的胚胎百分比。该测定可用于自受精雌雄同体和雄性/雌雄同体杂交。由于 秀丽隐杆线虫 的生命周期较短,该协议可以在不到1周的时间内完成。胚胎活力测定和育雏大小可用作参与减数分裂、受精或胚胎发育的基因的首次分析,并且是更高级研究人员和研究新手(本科生和一年级研究生)的合适方案。
The authors have nothing to disclose.
Jaramillo-Lambert实验室的工作得到了美国国立卫生研究院NIGMS R35GM142524的支持。所有 秀丽隐杆线虫 菌株均由 Caenorhabditis 遗传学中心提供,该中心由美国国立卫生研究院资助,P40 OD010440。 图 1D 是使用 Biorender.com 创建的。
Materials | |||
35 mm Petri dishes | Tritech research | T3501 | Semi-stackable, non-vented. |
Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For MYOB |
Bacto-Peptone | Gibco | 211677 | For MYOB |
Cholestrol | Sigma | C8503 | For MYOB |
Sodium Chloride | J.T. Baker | FW 58.440 | For MYOB |
Trizma Base | Sigma | T1503 | For MYOB |
Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | For MYOB |
Strains | |||
C. elegans wild type strain | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | |
Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
him-5(e1490) | Caenorhabditis Genetics Center | DR466 | |
spo-11(ok79) | Caenorhabditis Genetics Center | AV106 | |
Equipment/software | |||
Differential cell counter | Fischer Scientific | 02-670-12 | |
MicroSoft Excel or Prism | MicroSoft or GraphPad | For recording and creating graphical representations of data. | |
platinum wire | Tritech research | PT9901 | For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick). |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.) |
worm pick handle | Tritech research | TWPH1 | For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette. |