Vi etablerte en musemodell av kronisk leverfibrose, som gir en egnet dyremodell for virusindusert leverfibrose mekanistisk studie av biliær atresi (BA) og en plattform for fremtidige BA-behandlinger.
Biliær atresi (BA) er en dødelig sykdom som involverer obstruktiv gulsott, og det er den vanligste indikasjonen for levertransplantasjon hos barn. På grunn av den komplekse etiologien og ukjent patogenese er det fortsatt ingen effektive medikamentelle behandlinger. For tiden er den klassiske BA-musemodellen indusert av rhesus rotavirus (RRV) den mest brukte modellen for å studere patogenesen av BA. Denne modellen er preget av vekstretardering, gulsott av hud og slimhinner, leire avføring og mørk gul urin. Histopatologien viser alvorlig leverbetennelse og obstruksjon av de intrahepatiske og ekstrahepatiske gallekanalene, som ligner symptomene på human BA. Imidlertid mangler leveren til sluttstadiet mus i denne modellen fibrose og kan ikke fullt ut simulere egenskapene til leverfibrose i klinisk BA. Den presenterte studien utviklet en ny BA-musemodell av kronisk leverfibrose ved å injisere 5-10 μg anti-Ly6G-antistoff fire ganger, med hull på 2 dager etter hver injeksjon. Resultatene viste at noen av musene vellykket dannet kronisk BA med typisk fibrose etter tidsforløpet, noe som betyr at disse musene representerer en egnet dyremodell for virusindusert leverfibrose mekanistisk studie av BA og en plattform for å utvikle fremtidige BA-behandlinger.
Biliær atresi (BA) er en alvorlig hepatobiliær sykdom som ofte forekommer hos spedbarn og små barn; Spesielt presenterer den som en utslettende kolangiopati med neonatal gulsott og blek avføring1. Dens kliniske egenskaper er inflammatorisk ødeleggelse av intrahepatiske og ekstrahepatiske gallekanaler og progressiv fibrose, som til slutt utvikler seg til leversvikt2. Ifølge statistikken er forekomsten av BA i asiatiske land høyere enn i europeiske og amerikanske land, og forekomsten av BA i asiatiske land er 1/8000. Etiologien til BA inkluderer virusinfeksjon, unormal gallegangsutvikling, immunforstyrrelser og genetiske variasjoner3. Kasai kirurgi er den mest brukte metoden for å forbedre kolestase hos barn med BA, men til syvende og sist kan dette ikke forhindre progresjon av fibrose4. Den nåværende behandlingen for BA er hovedsakelig avhengig av levertransplantasjon, som er begrenset av mangel på leverkilder. En grundig studie av patogenesen til BA er det mest direkte middelet for å løse utfordringene ved denne sykdommen. Studier av patogenesen til BA er imidlertid hovedsakelig avhengige av BA-dyremodeller, og det er avgjørende å velge en passende dyremodell.
De fleste histopatologiske studier av BA har vist at gallegangshyperplasi (BDP), galletromlose og portalvenefibrose er de viktigste patologiske egenskapene til BA, og andre patologiske trekk av forskjellige karakterer eksisterer samtidig, for eksempel portal inflammatorisk celleinfiltrasjon og hepatocytthevelse 5,6. For tiden finnes det en rekke musemodeller som etterligner BA, for eksempel den kroniske 3,5-die-thoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidin (DDC)-matede musemodellen med segmental gallegangsobstruksjon og perikolangitt som involverer de ekstrahepatiske gallegangene7 og musemodellen av leverfibrose med en intraperitoneal injeksjon av karbontetraklorid8. Gallegangsligeringsmodellen (BDL) er preget av gulsott og rask portalvenefibrose9. Den alfa-naftylisotiocyanat (ANIT)-matede musemodellen presenterer med kolangitt begrenset til den intrahepatiske gallegangen og hepatocyttskade10. En musemodell med langvarig gulsott induseres av forsinket rhesus rotavirus (RRV) inokulasjon11. Selv om det finnes en rekke dyremodeller, spesielt musemodeller, har hver modell sine egne begrensninger. De kan bare simulere en del av sykdomsegenskapene til BA, for eksempel akutt betennelse eller leverfibrose i prosessen med biliær atresi, og det er ingen modell som er svært konsistent med sykdomsprosessen og patologiske trekk ved BA.
Den klassiske BA-musemodellen er indusert av RRV, og denne modellen er den mest liknende modellen til BA hos mennesker. Imidlertid, mens RRV-induserte BA-modellmus viser lignende kliniske symptomer og patologiske egenskaper til noen av de av ekstrahepatisk biliær atresi, mangler denne modellen leverfibrose, noe som i stor grad begrenser den grundige studien av BA-mekanismene og utviklingen av nye behandlinger12. Derfor utviklet denne studien en ny BA-musemodell av kronisk leverfibrose. Anti-Ly6G-antistoff ble injisert intraperitonealt før RRV-inokulasjon på fødselsdagen. Deretter ble 5-10 μg anti-Ly6G antistoff injisert fire ganger, med mellomrom på 2 dager mellom hver injeksjon. BA-symptomene hos mus ble forbedret, overlevelsestiden ble forlenget, og musene gikk inn i kronisk fibrosestadium. Denne modellen simulerer ikke bare den akutte faseresponsen til BA, men etterligner også leverprosessene og progressiv fibrose. Dermed er det en mer egnet dyremodell for den mekanistiske studien av BA, og det kan gi et teoretisk grunnlag for å utvikle fremtidige behandlinger for BA.
Gr-1-molekylet er en myeloide-avledet celleoverflatemarkør opprinnelig funnet å være uttrykt i nøytrofiler13. Uttømmingen av anti-Ly6G-antistoffer reduserer sirkulerende nøytrofiler med mer enn 90% og endrer responsen aktivert av andre immunceller. Funksjonene til Gr-1+ cellepopulasjoner har blitt rapportert i forskjellige studier ved bruk av spesifikke scavenging antistoffer, med varierende effekter identifisert på cytokiner og mediert immunbeskyttelse14. Vi har studert funksjonen til Gr-1+ celler i RRV-inokulerte BA-musemodeller. Men siden Gr-1-molekylet ikke har blitt funnet å være uttrykt hos mennesker, har et lignende molekyl, CD177, blitt studert hos BA-pasienter15. Våre data beviser betydningen av Gr-1+ cellepopulasjoner, spesielt i kronisk fibrotisk fase av sykdommen, og gir en egnet dyremodell for å undersøke potensielle BA-terapier.
I vår studie brukte vi anti-Ly6G-antistoff for å eliminere eller redusere Gr-1 + celler i en musemodell av biliær atresi infisert med RRV for å forbedre akutt BA-syndrom, forlenge overlevelsesraten og gjøre det mulig for BA-mus å gå inn i kronisk fase. Reduksjon av antistoffdosen kan føre til kronisk BA med leverfibrose, noe som indikerer at antall Gr-1+ celler endrer resultatet av BA i akutte og kroniske faser. I vår tidligere studie ble Gr-1 + -celler redusert etter administrering av anti-Ly6G-antistoff, og den totale overlevelsesstatusen til BA-musene ble forbedret15. Samtidig er det rapportert at Gr-1+ makrofager19, Gr-1+ nøytrofile20, Gr-1+ myeloide celler21 og Gr-1+ granulocytter kan forsterke fibrose i noen dyremodeller22. I denne studien ble imidlertid Gr-1+ celler hos mus delvis utarmet med lave doser anti-Ly6G-antistoff, og kollagenavsetninger forble. Som et resultat kan det være behov for mer tid til å behandle sykdommen grundigere.
Anvendelsen av anti-Ly6G-antistoffet reduserte betennelse, delvis bevarte gallegangene og forhindret akutt BA-indusert død hos mus. Imidlertid gikk bare 20% til 30% av musene inn i kronisk fase av BA; Dette kan være relatert til tidspunkt og antall injeksjoner av anti-Ly6G antistoff. Vi må utforske dette nøkkelpunktet videre for å forbedre suksessraten. I tillegg vurderer vi at ikke bare Gr-1+ celler, men også andre immunceller kan spille viktige roller, som NK-celler, T-celler, B-celler og makrofager.
Når det gjelder protokollen, må noen detaljer noteres. (i) For å unngå lekkasje av injiserte legemidler bruker vi en 1 ml insulinsprøyte med en nål på 0,33 mm diameter, fordi nålediameteren er liten og nålehullet i sprøyten er lite, noe som bidrar til å redusere muligheten for legemiddellekkasje. (ii) Før injeksjonen skal musen festes for å forhindre at den beveger seg, unngå legemiddellekkasje og dermed ytterligere sikre den eksperimentelle effekten. (iii) Under legemiddelinjeksjon injiserte vi stoffet i overflaten eller nedre margin av museleveren så langt som mulig, slik at stoffet kom inn i magen og fullstendig kontaktet leveren for å tre i kraft. (iv) Injeksjonen er vanligvis laget fra øvre høyre lår av musen, fordi den nyfødte musens mage og milt er i venstre underliv, og magen er full av melk. Hvis nålen settes inn fra venstre side, kan den lett punktere magen, forårsake melk å strømme inn i magen, eller punktere milten, forårsaker blødning.
CD177 er en homolog av Ly6G, og uttrykket av CD177 hos BA-pasienter har blitt undersøkt. CD177 kan brukes som en markør for tidlig diagnose av BA hos barn, noe som indikerer at CD177+ celler spiller en betydelig rolle i løpet av BA23. Ved å analysere RNA-sekvenseringsdataene fant teamet vårt at CD177-celler var den dominerende populasjonen av Gr-1 + -celler; Samtidig viste Cd177−/− BALB/c-mus vaksinert med RRV forsinket debut av BA og redusert sykelighet og mortalitet18. Dermed har vår kroniske BA-musemodell åpenbare fordeler for å studere patogenesen og sykdomsprogresjonen til BA; det gir også en egnet dyremodell for å studere potensielle behandlinger for BA.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (81974056) til RZ og fra National Nature Youth Foundation of China (82101808) og Science and Technology Planning Project of Guangzhou (nr. 202102020196) til Z.L.
Balb/c mouse | Guangdong Skarjingda Biotechnology Co., LTD | 20221000112 | |
rat anti-mouse Ly6G | Bio X Cell | clone 1A8 | West Lebanon, NH |
rat anti-mouse cytokeratin 19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | clone TROMA III | Iowa City, IA |
rat anti-mouse F4/80 | R&D Systems | MAB5580 | Minneapolis, MN |
RRV strain | ATCC | MMU 18006 | Manassas, VA |
Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX7 | |
Leica light microscopy | Leica Microsystems | Leica DMI8+DFC7000T | Wetzlar, Germany |
Hitachi Pre-Analytical Process Automation System | Hitachi | 7600 Clinical Analyzer | Tokyo, Japan |
Isoflurane anesthetic | RWD | R510-22-10 | |
Rhodamine 123 | Sigma-Aldrich | 83702 | |
sirius red dye | Leagene | DC0041 | |
paraffin microtome | Leica Microsystems | RM2235 | |
neutral gum | Solarbio | G8590 |