نموذج فأر لتليف الكبد المزمن لدراسة رتق القناة الصفراوية
Summary
أنشأنا نموذجا للفأر لتليف الكبد المزمن ، والذي يوفر نموذجا حيوانيا مناسبا للدراسة الميكانيكية لتليف الكبد الناجم عن الفيروس لرتق القناة الصفراوية (BA) ومنصة لعلاجات BA المستقبلية.
Abstract
رتق القناة الصفراوية (BA) هو مرض قاتل ينطوي على اليرقان الانسدادي ، وهو المؤشر الأكثر شيوعا لزراعة الكبد عند الأطفال. بسبب المسببات المعقدة والتسبب غير المعروف ، لا توجد حتى الآن علاجات دوائية فعالة. في الوقت الحاضر ، يعد نموذج الفأر BA الكلاسيكي الناجم عن فيروس الروتا الريسوس (RRV) هو النموذج الأكثر استخداما لدراسة التسبب في BA. يتميز هذا النموذج بتأخر النمو واليرقان في الجلد والغشاء المخاطي والبراز الطيني والبول الأصفر الداكن. يظهر التشريح المرضي التهاب الكبد الحاد وانسداد القنوات الصفراوية داخل الكبد وخارج الكبد ، والتي تشبه أعراض BA البشرية. ومع ذلك ، فإن كبد الفئران في المرحلة النهائية في هذا النموذج يفتقر إلى التليف ولا يمكنه محاكاة خصائص تليف الكبد بشكل كامل في BA السريري. طورت الدراسة المقدمة نموذجا جديدا للفأر BA لتليف الكبد المزمن عن طريق حقن 5-10 ميكروغرام من الأجسام المضادة ل Ly6G أربع مرات ، مع وجود فجوات لمدة يومين بعد كل حقنة. أظهرت النتائج أن بعض الفئران نجحت في تكوين BA المزمن مع تليف نموذجي بعد الفاصل الزمني ، مما يعني أن هذه الفئران تمثل نموذجا حيوانيا مناسبا للدراسة الميكانيكية لتليف الكبد الناجم عن الفيروس ل BA ومنصة لتطوير علاجات BA المستقبلية.
Introduction
رتق القناة الصفراوية (BA) هو مرض كبدي خطير يحدث غالبا عند الرضع والأطفال الصغار. على وجه التحديد ، يظهر على شكل اعتلال الأقنية الصفراوية مع اليرقان الوليدي والبراز الشاحب1. خصائصه السريرية هي التدمير الالتهابي للقنوات الصفراوية داخل الكبد وخارج الكبد والتليف التدريجي ، والذي يتطور في النهاية إلى فشل الكبد2. وفقا للإحصاءات ، فإن معدل الإصابة ب BA في الدول الآسيوية أعلى منه في الدول الأوروبية والأمريكية ، ومعدل الإصابة ب BA في الدول الآسيوية هو 1/8,000. تشمل مسببات BA العدوى الفيروسية ، وتطور القناة الصفراوية غير الطبيعي ، واضطرابات المناعة ، والاختلافات الجينية3. جراحة كاساي هي الطريقة الأكثر استخداما لتحسين ركود صفراوي لدى الأطفال المصابين ب BA ، ولكن في النهاية ، هذا لا يمكن أن يمنع تطور التليف4. يعتمد العلاج الحالي ل BA بشكل أساسي على زراعة الكبد ، والتي تقتصر على نقص مصادر الكبد. دراسة متعمقة للتسبب في BA هي الوسيلة الأكثر مباشرة لحل تحديات هذا المرض. ومع ذلك ، تعتمد الدراسات حول التسبب في BA بشكل أساسي على النماذج الحيوانية BA ، ومن الأهمية بمكان اختيار نموذج حيواني مناسب.
أظهرت معظم الدراسات النسيجية المرضية ل BA أن تضخم القناة الصفراوية (BDP) ، وتجلط الصفراء ، وتليف الوريد البابي هي أهم السمات المرضية ل BA ، وتوجد سمات مرضية أخرى من درجات مختلفة في نفس الوقت ، مثل تسلل الخلايا الالتهابية البابية وتورم خلايا الكبد 5,6. في الوقت الحاضر ، هناك مجموعة متنوعة من نماذج الفئران التي تحاكي BA ، مثل نموذج الفأر المزمن 3،5-die-thoxycarbonyl-1،4-dihydrocollidine (DDC) مع انسداد القناة الصفراوية القطاعية والتهاب الأقنية الصفراوية الذي يشمل القنوات الصفراوية خارج الكبد7 ونموذج الفأر لتليف الكبد مع حقن داخل الصفاق من رابع كلوريد الكربون8. يتميز نموذج ربط القناة الصفراوية (BDL) باليرقان وتليف الوريد البابيالسريع 9. يقدم نموذج الفأر الذي يتغذى على ألفا نفثيليزوثيوسيانات (ANIT) مع التهاب الأقنية الصفراوية المحصور في القناة الصفراوية داخل الكبد وإصابة خلايا الكبد10. يتم تحفيز نموذج الفأر المصاب باليرقان لفترات طويلة عن طريق التلقيح المتأخر لفيروس الروتا الريسوس (RRV)11. على الرغم من وجود مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية ، وخاصة نماذج الفئران ، إلا أن كل نموذج له حدوده الخاصة. يمكنهم فقط محاكاة جزء من خصائص مرض BA ، مثل الالتهاب الحاد أو تليف الكبد في عملية رتق القناة الصفراوية ، ولا يوجد نموذج يتوافق بشكل كبير مع عملية المرض والسمات المرضية ل BA.
يتم تحفيز نموذج الماوس BA الكلاسيكي بواسطة RRV ، وهذا النموذج هو النموذج الأكثر تشابها مع BA في البشر. ومع ذلك ، في حين أن الفئران النموذجية BA التي يسببها RRV تظهر أعراضا سريرية وخصائص مرضية مماثلة لبعض تلك الخاصة برتق القناة الصفراوية خارج الكبد ، فإن هذا النموذج يفتقر إلى تليف الكبد ، مما يحد بشكل كبير من الدراسة المتعمقة لآليات BA وتطوير علاجات جديدة12. لذلك ، طورت هذه الدراسة نموذجا جديدا للفأر BA لتليف الكبد المزمن. تم حقن الجسم المضاد ل Ly6G داخل الصفاق قبل تلقيح RRV في يوم الولادة. ثم ، تم حقن 5-10 ميكروغرام من الأجسام المضادة ل Ly6G أربع مرات ، مع وجود فجوات لمدة يومين بين كل حقنة. تحسنت أعراض BA للفئران ، وطال وقت البقاء على قيد الحياة ، ودخلت الفئران مرحلة التليف المزمن. لا يحاكي هذا النموذج استجابة المرحلة الحادة ل BA فحسب ، بل يحاكي أيضا عمليات الكبد والتليف التدريجي. وبالتالي ، فهو نموذج حيواني أكثر ملاءمة للدراسة الميكانيكية لمكتبة الإسكندرية ، ويمكن أن يوفر أساسا نظريا لتطوير العلاجات المستقبلية ل BA.
جزيء Gr-1 هو علامة سطح خلية مشتقة من النخاع تم العثور عليها في الأصل في العدلات13. يقلل استنفاد الأجسام المضادة المضادة ل Ly6G من العدلات المنتشرة بأكثر من 90٪ ويغير الاستجابة التي تنشطها الخلايا المناعية الأخرى. تم الإبلاغ عن وظائف مجموعات خلايا Gr-1 + في دراسات مختلفة باستخدام أجسام مضادة كسح محددة ، مع تأثيرات متفاوتة تم تحديدها على السيتوكينات والحماية المناعية بوساطة14. لقد درسنا وظيفة خلايا Gr-1 + في نماذج فأر BA الملقحة ب RRV. ومع ذلك ، نظرا لعدم العثور على جزيء Gr-1 في البشر ، فقد تمت دراسة جزيء مماثل ، CD177 ، في مرضىBA 15. تثبت بياناتنا أهمية مجموعات خلايا Gr-1 + ، خاصة في المرحلة الليفية المزمنة من المرض ، وتوفر نموذجا حيوانيا مناسبا للتحقيق في علاجات BA المحتملة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في دراستنا ، استخدمنا الأجسام المضادة المضادة ل Ly6G لإزالة أو تقليل خلايا Gr-1 + في نموذج فأر من رتق القناة الصفراوية المصاب ب RRV لتحسين متلازمة BA الحادة ، وإطالة معدل البقاء على قيد الحياة ، وتمكين الفئران BA من دخول المرحلة المزمنة. يمكن أن يؤدي تقليل جرعة الأجسام المضادة إلى BA المزمن مع التليف الكبدي ، مما يشير إلى أن عدد خلايا Gr-1 + يغير نتيجة BA في المراحل الحادة والمزمنة. في دراستنا السابقة ، تم تقليل خلايا Gr-1 + بعد إعطاء الأجسام المضادة المضادة ل Ly6G ، وتم تحسين حالة البقاء الإجمالية لفئران BA15. في الوقت نفسه ، تم الإبلاغ عن أن Gr-1 + البلاعم19 ، Gr-1 + العدلات 20 ، الخلايا النخاعية Gr-1 +21 ، والخلايا المحببة Gr-1 + يمكن أن تعزز التليف في بعض النماذج الحيوانية 22. ومع ذلك ، في هذه الدراسة ، استنفدت خلايا Gr-1 + في الفئران جزئيا بجرعات منخفضة من الأجسام المضادة ل Ly6G ، وبقيت رواسب الكولاجين. نتيجة لذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من الوقت لمعالجة المرض بشكل أكثر شمولا.
أدى تطبيق الجسم المضاد ل Ly6G إلى تقليل الالتهاب ، والحفاظ جزئيا على القنوات الصفراوية ، ومنع الموت الحاد الناجم عن BA في الفئران. ومع ذلك ، فقط 20 ٪ إلى 30 ٪ من الفئران دخلت المرحلة المزمنة من BA. قد يكون هذا مرتبطا بالنقطة الزمنية وعدد حقن الأجسام المضادة ل Ly6G. نحن بحاجة إلى مزيد من استكشاف هذه النقطة الرئيسية لتحسين معدل النجاح. بالإضافة إلى ذلك ، نعتبر أنه ليس فقط خلايا Gr-1 + ولكن أيضا الخلايا المناعية الأخرى قد تلعب أدوارا مهمة ، مثل الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا التائية والخلايا البائية والبلاعم.
أما بالنسبة للبروتوكول ، فيجب ملاحظة بعض التفاصيل. (ط) من أجل تجنب تسرب العقاقير المحقونة ، نستخدم حقنة أنسولين سعة 1 مل مع إبرة قطرها 0.33 مم ، لأن قطر الإبرة صغير ، وثقب الإبرة في المحقنة صغير ، مما يساعد على تقليل إمكانية تسرب الدواء. (ii) قبل الحقن ، يجب تثبيت الماوس لمنعه من الحركة ، وتجنب تسرب الدواء ، وبالتالي ضمان التأثير التجريبي بشكل أكبر. (iii) أثناء حقن الدواء ، قمنا بحقن الدواء في السطح أو الهامش السفلي لكبد الفأر قدر الإمكان حتى يدخل الدواء إلى البطن ويتصل تماما بالكبد ليصبح ساري المفعول. (iv) عادة ما يتم الحقن من أعلى الفخذ الأيمن للفأر ، لأن معدة الفأر حديث الولادة وطحاله في البطن الأيسر ، والمعدة مليئة بالحليب. إذا تم إدخال الإبرة من الجانب الأيسر ، فيمكنها بسهولة ثقب المعدة ، مما يتسبب في تدفق الحليب إلى البطن ، أو ثقب الطحال ، مما يسبب النزيف.
CD177 هو متجانس ل Ly6G ، وقد تم التحقيق في تعبير CD177 في مرضى BA. يمكن استخدام CD177 كعلامة للتشخيص المبكر ل BA عند الأطفال ، مما يشير إلى أن خلايا CD177 + تلعب دورا مهما في مسار BA23. من خلال تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي ، وجد فريقنا أن خلايا CD177 كانت السكان المهيمنين لخلايا Gr-1 + . وفي الوقت نفسه ، أظهرت الفئران Cd177− / – BALB / c الملقحة ب RRV بداية متأخرة ل BA وانخفاض المراضة والوفيات18. وبالتالي ، فإن نموذج فأر BA المزمن لدينا له مزايا واضحة لدراسة التسبب في المرض وتطور المرض في BA. كما يوفر نموذجا حيوانيا مناسبا لدراسة العلاجات المحتملة ل BA.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81974056) إلى R.Z. ومن مؤسسة شباب الطبيعة الوطنية في الصين (82101808) ومشروع تخطيط العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو (رقم 202102020196) إلى Z.L.
Materials
| Balb/c mouse | Guangdong Skarjingda Biotechnology Co., LTD | 20221000112 | |
| rat anti-mouse Ly6G | Bio X Cell | clone 1A8 | West Lebanon, NH |
| rat anti-mouse cytokeratin 19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | clone TROMA III | Iowa City, IA |
| rat anti-mouse F4/80 | R&D Systems | MAB5580 | Minneapolis, MN |
| RRV strain | ATCC | MMU 18006 | Manassas, VA |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX7 | |
| Leica light microscopy | Leica Microsystems | Leica DMI8+DFC7000T | Wetzlar, Germany |
| Hitachi Pre-Analytical Process Automation System | Hitachi | 7600 Clinical Analyzer | Tokyo, Japan |
| Isoflurane anesthetic | RWD | R510-22-10 | |
| Rhodamine 123 | Sigma-Aldrich | 83702 | |
| sirius red dye | Leagene | DC0041 | |
| paraffin microtome | Leica Microsystems | RM2235 | |
| neutral gum | Solarbio | G8590 |
References
- Lakshminarayanan, B., Davenport, M. Biliary atresia: A comprehensive review. Journal of Autoimmunity. 73, 1-9 (2016).
- Bassett, M. D., Murray, K. F. Biliary atresia: Recent progress. Journal of Clinical Gastroenterology. 42 (6), 720-729 (2008).
- Bezerra, J. A., et al. Biliary atresia: Clinical and research challenges for the twenty-first century. Hepatology. 68 (3), 1163-1173 (2018).
- Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374 (9702), 1704-1713 (2009).
- Lee, W. S., Looi, L. M. Usefulness of a scoring system in the interpretation of histology in neonatal cholestasis. World Journal of Gastroenterology. 15 (42), 5326-5333 (2009).
- Russo, P., et al. Key histopathologic features of liver biopsies that distinguish biliary atresia from other causes of infantile cholestasis and their correlation with outcome: A multicenter study. The American Journal of Surgical Pathology. 40 (12), 1601-1615 (2016).
- Fickert, P., et al. Characterization of animal models for primary sclerosing cholangitis (PSC). Journal of Hepatology. 60 (6), 1290-1303 (2014).
- Sonoda, S., et al. Biliary atresia-specific deciduous pulp stem cells feature biliary deficiency. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 582 (2021).
- Xiao, Y., et al. Long noncoding RNA H19 contributes to cholangiocyte proliferation and cholestatic liver fibrosis in biliary atresia. Hepatology. 70 (5), 1658-1673 (2019).
- Desmet, V. J., Krstulović, B., Van Damme, B. Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis. The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).
- Luo, Z., Shivakumar, P., Mourya, R., Gutta, S., Bezerra, J. A. Gene expression signatures associated with survival times of pediatric patients with biliary atresia identify potential therapeutic agents. Gastroenterology. 157 (4), 1138-1152 (2019).
- Mariotti, V., Strazzabosco, M., Fabris, L., Calvisi, D. F. Animal models of biliary injury and altered bile acid metabolism. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1254-1261 (2018).
- Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40 (1), 35-48 (2008).
- McDermott, A. J., et al. The role of Gr-1(+) cells and tumour necrosis factor-α signalling during Clostridium difficile colitis in mice. Immunology. 144 (4), 704-716 (2015).
- Zhang, R., et al. The role of neonatal Gr-1(+) myeloid cells in a murine model of rhesus-rotavirus-induced biliary atresia. The American Journal of Pathology. 188 (11), 2617-2628 (2018).
- Fu, M., et al. A silver nanoparticle method for ameliorating biliary atresia syndrome in mice. Journal of Visualized Experiments. (140), e58158 (2018).
- Sy, J., Ang, L. C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Methods in Molecular Biology. 1897, 269-278 (2019).
- Zhang, R., et al. CD177(+) cells produce neutrophil extracellular traps that promote biliary atresia. Journal of Hepatology. 77 (5), 1299-1310 (2022).
- Engel, D. R., et al. CX3CR1 reduces kidney fibrosis by inhibiting local proliferation of profibrotic macrophages. Journal of Immunology. 194 (4), 1628-1638 (2015).
- Liang, M., et al. A modified murine model of systemic sclerosis: Bleomycin given by pump infusion induced skin and pulmonary inflammation and fibrosis. Laboratory Investigation. 95 (3), 342-350 (2015).
- Chen, Y., et al. Differential effects of sorafenib on liver versus tumor fibrosis mediated by stromal-derived factor 1 alpha/C-X-C receptor type 4 axis and myeloid differentiation antigen-positive myeloid cell infiltration in mice. Hepatology. 59 (4), 1435-1447 (2014).
- Tomasson, M. H., et al. Fatal myeloproliferation, induced in mice by TEL/PDGFbetaR expression, depends on PDGFbetaR tyrosines 579/581. Journal of Clinical Investigation. 105 (4), 423-432 (2000).
- Zhang, R., Huang, J., Shan, J., Chen, Y., Xia, H. Peripheral blood CD177(+) cells as an early diagnostic marker for biliary atresia: A prospective multicentre study in pediatric patients with cholestasis. Journal of Hepatology. 77 (6), 1714-1716 (2022).
