Summary

Adipocyt-specifieke ATAC-Seq met vetweefsels met behulp van fluorescentie-geactiveerde kernsortering

Published: March 17, 2023
doi:

Summary

We presenteren een protocol voor assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing (ATAC-seq) specifiek op adipocyten met behulp van kernsortering met vetweefsels geïsoleerd uit transgene reportermuizen met nucleaire fluorescentielabeling.

Abstract

Assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is een robuuste techniek die genoombrede chromatinetoegankelijkheidsprofilering mogelijk maakt. Deze techniek is nuttig geweest voor het begrijpen van de regulerende mechanismen van genexpressie in een reeks biologische processen. Hoewel ATAC-seq is aangepast voor verschillende soorten monsters, zijn er geen effectieve wijzigingen geweest van ATAC-seq-methoden voor vetweefsels. Uitdagingen met vetweefsels zijn de complexe cellulaire heterogeniteit, het grote lipidegehalte en de hoge mitochondriale besmetting. Om deze problemen op te lossen, hebben we een protocol ontwikkeld dat adipocyt-specifieke ATAC-seq mogelijk maakt door gebruik te maken van fluorescentie-geactiveerde kernsortering met vetweefsels van de transgene reporter Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) muis. Dit protocol produceert gegevens van hoge kwaliteit met minimale verspilde sequencing-reads, terwijl de hoeveelheid nucleusinvoer en reagentia wordt verminderd. Dit artikel bevat gedetailleerde stapsgewijze instructies voor de ATAC-seq-methode die is gevalideerd voor het gebruik van adipocytkernen geïsoleerd uit vetweefsel van muizen. Dit protocol zal helpen bij het onderzoek naar chromatinedynamica in adipocyten op verschillende biologische stimulaties, wat nieuwe biologische inzichten mogelijk zal maken.

Introduction

Vetweefsel, dat gespecialiseerd is voor het opslaan van overtollige energie in de vorm van lipidemoleculen, is een belangrijk orgaan voor metabole regulatie. De strikte controle van de vorming en het onderhoud van adipocyten is van vitaal belang voor de vetweefselfunctie en de energiehomeostase van het hele lichaam1. Veel transcriptionele regulatoren spelen een cruciale rol bij de controle van adipocytendifferentiatie, plasticiteit en functie; Sommige van deze regulatoren zijn betrokken bij metabole stoornissen bij de mens 2,3. Recente ontwikkelingen in high-throughput sequencingtechnieken voor genexpressie en epigenomische analyse hebben de ontdekking van de moleculaire regulatoren van adipocytenbiologie verder vergemakkelijkt4. Moleculaire profileringsstudies met behulp van vetweefsels zijn een uitdaging om uit te voeren vanwege de heterogeniteit van deze weefsels. Vetweefsel bestaat voornamelijk uit adipocyten, die verantwoordelijk zijn voor vetopslag, maar bevat ook verschillende andere celtypen, zoals fibroblasten, endotheelcellen en immuuncellen5. Bovendien is de cellulaire samenstelling van vetweefsel dramatisch veranderd als reactie op pathofysiologische veranderingen zoals temperatuur en voedingsstatus6. Om deze problemen te overwinnen, hebben we eerder een transgene reportermuis ontwikkeld, genaamd Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), die GFP-gelabelde ribosomen en mCherry-gelabelde biotinyleerde kernen produceert op een Cre-recombinase-afhankelijke manier7. Het dual-labeling systeem maakt het mogelijk om celtype-specifieke transcriptomische en epigenomische analyse uit te voeren met weefsels. Met behulp van NuTRAP-muizen gekruist met adipocyt-specifieke adiponectine-Cre-lijnen (Adipoq-NuTRAP), hebben we eerder genexpressieprofielen en chromatinetoestanden van pure adipocytenpopulaties in vivo gekarakteriseerd en bepaald hoe ze worden veranderd tijdens obesitas 7,8. Eerder stelden NuTRAP-muizen gekruist met bruine en beige adipocyt-specifieke Ucp1-Cre-lijnen (Ucp1-NuTRAP) ons in staat om de epigenomische remodellering van de zeldzame thermogene adipocytenpopulatie, beige adipocyten, te karakteriseren als reactie op temperatuurveranderingen9.

ATAC-seq is een veelgebruikte analysemethode om de toegankelijkheid van genoombrede chromatine te beoordelen. De hyperreactieve Tn5-transposase die in ATAC-seq wordt gebruikt, maakt de identificatie van open chromatinegebieden mogelijk door sequencingadapters te taggen in het chromatine-toegankelijke gebied vankernen 10. ATAC-seq is een eenvoudige methode, maar biedt robuuste resultaten en is zeer efficiënt, zelfs met monsters met een lage invoer. Het is dus een van de meest populaire epigenomische profileringsmethoden geworden en heeft bijgedragen aan het begrip van de regulerende mechanismen van genexpressie binnen diverse biologische contexten. Sinds het oorspronkelijke ATAC-seq protocol is gemaakt, zijn er verschillende ATAC-seq-afgeleide technieken verder ontwikkeld om het protocol voor verschillende soorten samples aan te passen en te optimaliseren. Fast-ATAC is bijvoorbeeld ontworpen voor het analyseren van bloedcelmonsters11, Omni-ATAC is een geoptimaliseerd protocol voor ingevroren weefselmonsters 12 en MiniATAC-seq is effectief voor embryo-analyse in een vroeg stadium13. Het toepassen van de ATAC-seq-methode op adipocyten, vooral uit weefselmonsters, is echter nog steeds een uitdaging. Naast de heterogeniteit van vetweefsel kan het hoge lipidegehalte interfereren met efficiënte recombinatiereacties door Tn5-transposase, zelfs na kernisolatie. Bovendien veroorzaakt het hoge mitochondriale gehalte in adipocyten, met name in bruine en beige adipocyten, een hoge mitochondriale DNA-contaminatie en verspilde sequencing-reads. Dit artikel beschrijft een protocol voor adipocyt-specifieke ATAC-seq met behulp van Adipoq-NuTRAP-muizen (figuur 1). Door gebruik te maken van fluorescentie-gelabelde kernsortering, maakt dit protocol het mogelijk om zuivere populaties van adipocytenkernen weg te verzamelen van andere verstorende celtypen en de efficiënte verwijdering van lipiden, mitochondriën en weefselresten. Daarom kan dit protocol celtypespecifieke gegevens van hoge kwaliteit genereren en verspilling van mitochondriale metingen minimaliseren, terwijl een verminderde hoeveelheid invoer en reagentia wordt gebruikt in vergelijking met het standaardprotocol.

Protocol

Dierverzorging en experimenten werden uitgevoerd volgens procedures die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Indiana University School of Medicine. 1. Voorbereidingen voor het begin van het experiment WeefselvoorbereidingVoor het labelen van adipocytenkernen kruist u NuTRAP-muizen met adipocyt-specifieke adiponectine-Cre-lijnen (Adipoq-Cre) om Adipoq-NuTRAP-muizen te genereren, die hemizygoot zijn voor zowel Adipoq-Cre a…

Representative Results

Om vetweefsel te analyseren met behulp van dit ATAC-seq-protocol, genereerden we Adipoq-NuTRAP-muizen die chow-diëten kregen; Vervolgens isoleerden we adipocytkernen uit epididymaal wit vetweefsel (eWAT), inguinaal wit vetweefsel (iWAT) en bruin vetweefsel (BAT) met behulp van flowcytometrie. De geïsoleerde kernen werden gebruikt voor tagmentatie, gevolgd door DNA-zuivering, PCR-amplificatie, kwaliteitscontrolestappen, sequencing en data-analyse, zoals hierboven beschreven. Het doel van dit representatieve experiment w…

Discussion

In dit artikel hebben we een geoptimaliseerd ATAC-seq-protocol gepresenteerd om de toegankelijkheid van adipocytspecifiek chromatine in vivo te beoordelen. Dit ATAC-seq-protocol met behulp van de Adipoq-NuTRAP-muis heeft met succes adipocyt-specifieke chromatine-toegankelijkheidsprofielen gegenereerd. De meest kritische factor voor succesvolle en reproduceerbare ATAC-seq experimenten is de kwaliteit van de kern. Het is van cruciaal belang om de ontleedde vetweefsels onmiddellijk in te vriezen in vloeibare stikst…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door het IUSM Showalter Research Trust Fund (naar H.C.R.), een IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases Pilot and Feasibility grant (naar H.C.R.), het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK129289 naar H.C.R.), en de American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 naar H.C.R.).

Materials

Animals
Adiponectin-Cre mouse The Jackson Laboratory 28020
NuTRAP mouse The Jackson Laboratory 29899
Reagents & Materials
1.5 mL DNA-LoBind tubes Eppendorf 86-923
100 µm cell strainer Falcon 352-360
15 mL tubes VWR 525-1071
2x TD buffer Illumina 15027866
384-well PCR plate Applied biosystem 4483285
40 µm cell strainer Falcon 352-340
50 mL tubes VWR 525-1077
AMPure XP reagent (SPRI beads) Beckman Coulter A63881
Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit Agilent Technologies 5067-4626
Clear adhesive film Applied biosystem 4306311
DNase/RNase-free distilled water Invitrogen 10977015
Dounce tissue grinder DWK Life Sciences 357542
DTT Sigma D9779
DynaMag-96 side skirted magnet Thermo Fishers 12027
FACS tubes Falcon  28719128
HEPES Boston BioProducts BBH-75
Hoechst 33342 Invitrogen 2134015
KCl (2 M) Boston BioProducts MT-252
Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips EpiCypher 10-0008
MgCl2 (1 M) Boston BioProducts MT-200
MinElute PCR purification kit Qiagen 28004
NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix BioLabs M0541S
NP40 Thermo Fishers 28324
PCR 8-tube strip USA scientific 1402-4708
Protease inhibitor cocktail (100x) Thermo Fishers 78439
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851
Sucrose Sigma S0389-1KG
SYBR Green I (10,000x) Invitrogen S7563
TDE I enzyme Illumina 15027865
Instruments
Flow cytometer BD Biosciences FACSAria Fusion
Qubit fluorometer Invitrogen Q33226
Real-Time PCR system Thermo Fishers QuantStudio 5

References

  1. Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
  2. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
  3. Bielczyk-Maczynska, E. White adipocyte plasticity in physiology and disease. Cells. 8 (12), 1507 (2019).
  4. Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies. Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).
  5. Esteve Rafols, M. Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity. Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).
  6. Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications. Experimental and Molecular Medicine. 48, e215 (2016).
  7. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  8. Roh, H. C., et al. Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPARγ activity and elevated TGFβ-SMAD signaling. Molecular Metabolism. 42, 101086 (2020).
  9. Roh, H. C., et al. Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity. Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).
  10. Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  11. Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
  12. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  13. Wu, J., et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA. Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).
  14. Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
  15. So, J., et al. Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility. Molecular Metabolism. 66, 101619 (2022).
  16. Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing. STAR Protocols. 2 (3), 100805 (2021).
  17. Heyward, F. D., et al. Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin’s hunger-suppressing effects. bioRxiv. , (2022).

Play Video

Cite This Article
Kim, K., Taleb, S., So, J., Wann, J., Cheol Roh, H. Adipocyte-Specific ATAC-Seq with Adipose Tissues Using Fluorescence-Activated Nucleus Sorting. J. Vis. Exp. (193), e65033, doi:10.3791/65033 (2023).

View Video