이 프로토콜을 통해 숙주에 대한 프로파지의 영향을 밝힐 수 있습니다. 박테리아 배양은 용원 상태를 가장 잘 지원하는 조건을 사용하여 동기화되어 자발적 유도를 제한합니다. RT-qPCR은 프로파지 제한 유전자 및 파지 제어에서 결합되지 않은 유전자를 용해 복제 주기 동안 발현되는 유전자와 명확하게 구별합니다.
온대 파지는 대부분의 박테리아 게놈에서 프로파지로 통합되는 것으로 발견됩니다. 일부 프로파지는 비밀스럽고 박테리아 염색체에 고정되어 있지만 다른 프로파지는 활성화되어 자발적으로 또는 유도 인자에 노출되어 복제 형태로 촉발될 수 있습니다. 프로파지는 일반적으로 숙주 세포에 독소 생산 또는 기타 독성 관련 형질을 부여하는 능력과 관련이 있습니다. 보다 최근의 연구는 그들이 숙주의 생리학을 변화시키는 데 훨씬 더 큰 역할을 할 수 있다는 것을 보여주었습니다. 여기에 설명된 기술을 통해 프로파지가 기회 박테리아 녹농균의 유전자 발현에 어떤 영향을 미치는지 조사할 수 있었습니다.
이 연구에서, 야생형 녹농균 균주 PAO1의 성장은 Liverpool Epidemic Strain(LES) LESB58의 다양한 프로파지 조합을 운반하는 동인성 라이소겐의 성장과 비교되었습니다. 라이소겐 배양에서 박테리아 세포의 일부는 파지 입자의 조립과 관련된 것과 같은 후기 파지 유전자의 세포당 높은 수준의 발현으로 용해성 박테리오파지 복제(자발적 유도)를 지원하여 라이소겐 제한 유전자 발현과 관련된 낮은 수준의 유전자 발현을 마스킹합니다. 따라서 자발적 유도의 영향은 라이소겐 집단에서 프로파지 유전자 발현을 모호하게 할 수 있습니다.
성장 프로파일링 실험은 초기 기하급수적 성장 단계에서 최소화된 자발적 유도를 식별하는 데 사용되었습니다. 이 연구는 초기 기하급수적 성장 단계에서 샘플 배양을 준비하는 방법과 낮은 세포 수에도 불구하고 적절한 대조군을 설정하는 방법을 보고합니다. 이러한 프로토콜은 다양한 조건에서 야생형 및 용원 박테리아의 신뢰할 수 있고 재현 가능한 비교를 보장하여 프로파지 게놈의 전사체 프로파일링을 개선하고 이전에 인식되지 않은 프로파지 기능을 식별하는 데 도움이 됩니다.
최근에는 항생제 내성1 및 CRISPR-Cas 기반 유전자 편집2을 해결하기 위한 파지 요법이 박테리오파지 연구에 대한 새로운 관심을 불러일으켰습니다. 다시 말하지만, 생명공학의 발전은 박테리아와 파지 사이의 상호작용에 대한 더 깊은 연구를 가능하게 했다3. 그러나 파지의 치료적 사용(“파지 요법”)은 파지가 독성 및 내성 유전자를 수평적으로 전달할 수 있는 능력을 가진 이동성 유전 요소로 작용할 수 있다는 우려로 인해 방해를 받고 있다4. “암흑물질(dark matter)”5 (알려지지 않은 기능을 가진 유전자들)의 광활함은 우려스러우면서도 매력적이다. 암흑물질은 파지 생물학에 대한 우리의 이해의 격차로 간주되며, 분자 도구 및 잠재적인 새로운 치료법을 위한 미개척 자원으로 간주된다6. 개선된 유전자 주석 7,8,9 및 새로운 펩타이드 접힘 알고리즘(10)과 함께 고처리량 염기서열 분석 기술의 개발은 파지 유전자의 검출, 설명 및 기능적 예측을 개선하고 있습니다. 그러나 과학은 배양이나 현실 세계에서 대부분의 파지의 유전자 기능을 검증하기에는 아직 멀었다.
RNA 염기서열분석(RNA-Seq)은 파지 감염 중 유전자 발현을 전체적으로 매핑할 수 있으며 용해 및 용원 주기에 관여하는 파지 및 박테리아 요소에 대한 이해를 크게 향상시켰습니다11,12. 용원 과정(lysogenic process) 동안, 온대 파지 게놈(temperate phage genome)은 박테리아 DNA에 통합되어 프로파지(prophage)가 된다 13. 글로벌 유전자 발현 프로파일링 실험은 온대 파지 게놈에 암호화되어 있지만 용원 상태 동안에만 발현되는 프로파지-제한 유전자를 식별하는데 사용될 수 있다11. 이러한 유전자는 파지 구조 단백질을 암호화하지 않으며 파지 감염 과정에 관여하지 않습니다. RNA-Seq는 기능 향상을 유도하거나 기존 박테리아 유전자를 조절하여 박테리아가 변화하는 환경에 적응할 수 있도록 함으로써 박테리아 숙주의 생물학에 영향을 미칠 가능성이 더 높은 유전자를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 다양한 박테리아 기능을 제어하는 미생물 꼭두각시 주인 역할을 하는 프로파지의 능력을 연구할 수 있습니다.
프로파지 제한 유전자 발현의 효과적인 분석에는 두 가지 주요 장벽이 있습니다. 첫째, 취약한 호스트의 가용성이 핵심 문제입니다. 정의에 따르면, 프로파지는 이미 특정 숙주 게놈에 통합되어 있기 때문에 프로파지의 존재 여부와 관계없이 전체 유전자 발현을 비교하기 위해 감수성 야생형 숙주를 찾는 것은 어렵습니다. 이는 다른 감수성 숙주의 de novo 감염 또는 숙주 게놈의 나머지 부분을 방해하지 않고 원래 야생형 분리물에서 프로파지의 삭제를 통해 달성할 수 있습니다. 두 번째 장벽은 용원 개체군의 이질적인 특성에 있습니다. 일부 프로파지는 돌연변이 또는 재조합을 통해 분해되어 박테리아 게놈의 특정 위치에 고정되어 있는 “비밀”이 됩니다. 그러나, 다른 프로파지들은 “활동적”이며, 자발적으로 또는 유도 인자에 노출된 후에 복제적, 용해적 회로로 유도될 수 있다. 많은 용원 배양에서 자발적 유도 속도는 박테리아 세포의 일부가 항상 용해성 파지 복제를 겪고 있음을 의미합니다14,15,16. 이들 집단에서 후기 파지 유전자의 높은 수준의 발현은 리소겐 제한 유전자 발현과 관련된 낮은 수준의 유전자 발현을 가린다11,17. 자발적 프로파지 유도를 받는 리소겐의 비율은 성장 상태, 성장 조건 또는 기타 유발 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서 프로파지가 리소겐에 미치는 영향을 연구하기 위해서는 리소겐 상태에 유리하도록 성장 조건을 최적화하여 자발적인 프로파지 유도 사건을 최대한 최소화해야 합니다.
이 연구는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 리버풀 전염병 균주(LES)의 동거 프로파지 세트의 영향을 조사하기 위해 수행된 준비 작업을 보고합니다. 활성 프로파지를 LES에서 유도 및 분리하여 모델 녹농균 숙주 PAO116,18,19를 감염시키는 데 사용하였다. 야생형 녹농균 균주 PAO1 및 이의 라이소겐 PAO1Φ2의 전체 게놈 염기서열을 분석하여(30배 깊이에서) 야생형 균주의 정체를 확인하고 라이소겐이 동원성임을 확인했습니다. LES는 낭포성 섬유증 환자의 이환율 및 사망률 증가와 관련이 있으며, LES 파지(19)는 낭포성 섬유증 폐 환경에 대한 적응을 돕는 것으로 제안되었다16,19,20. 이러한 프로파지가 숙주20,21의 생물학에 영향을 미친다는 강력한 증거에도 불구하고, 대부분의 유전자 기능은 아직 특성화되지 않았으며, 상호작용의 구체적인 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있다. 전사체학 접근법은 통제된 숙주 배경에서 프로파지 유전자 기능을 경험적으로 밝혀낼 수 있습니다. 자발적 유도는 발현 프로파일에 영향을 미칠 수 있기 때문에 이 기사에서는 용원 상태를 선호하도록 성장 조건을 최적화하는 방법을 설명합니다. 이러한 배양 동기화는 PAO1에서 LES 파지 복제의 중요한 단계와 관련된 주요 유전자 마커의 발현 수준을 정량화하기 위해 Real-Time PCR로 검증할 수 있습니다. 동일한 접근법은 이전에 대장균 11,17,21,22에서 운동성, 내산성 및 항균성 내성에 영향을 미치는 Shiga-toxigenic 파지의 프로파지 제한 기능을 식별하는 데 사용되었습니다.
E. coli MC106137,38,39로부터 Stx 파지의 자발적 유도를 보다 정확하게 정량화하기 위해 이전에 플라크 분석에서 사용되었던 선택 가능한 지표 호스트의 생성이 녹농균 파지 LESΦ2에 대해 여기에 설명되어 있습니다. 이 개입은 시료 처리 단계와 시간을 줄여 여러 배양 조건에서 자발적 유도 속도를 동시에 평가할 수 있다는 추가적인 이점이 있습니다. 리팜피신-내성 변이체(40)의 생성 동안에 다른 돌연변이를 발생시킬 위험이 있다; 그러나 이 연구에서 진화된 균주는 관심 배양에서 플라크를 열거하기 위한 지표 숙주로만 사용되었으며 전사체 분석에는 포함되지 않았습니다. 선택 가능한 지표 균주가 관심 파지에 의한 감염에 동등하게 취약한 상태로 유지되는 한, 다른 후천성 돌연변이에 대한 우려는 없습니다. 그럼에도 불구하고, PAO1WT 및 PAO1RIF의 펄스장 겔 전기영동(PFGE) 분석에 의해 제한 단편 길이 다형성 프로파일의 차이가 검출되지 않았다(데이터 미도시).
숙주 세포를 선택할 때, 이미 프로파지를 가지고 있지 않은 지표 균주를 찾는 것은 드뭅니다. 예를 들어, PAO1은 사상체 프로파지 Pf4를 보유하고 있습니다. 이 연구의 실험 대조군은 특정 파지(이 경우 LES 프로파지 2)의 유전자 발현과 이 파지가 박테리아 유전자 발현에 미치는 영향을 직접 검사할 수 있도록 설계되었습니다. LES 프로파지 2를 운반하는 PAO1과 LES 프로파지 2가 결핍된 전사체(라이소겐과 비라이소겐 모두 내인성 Pf4를 운반함)의 전사체를 비교한 결과, 이는 숙주에 대한 Pf4의 영향을 배제하기 위한 내부 대조군 역할을 합니다. 추가적으로, Pf4는 통상적으로 숙주 세포(41 )에서 용해를 일으키지 않으며, 따라서 이들 실험의 결과를 교란시킬 수 없다는 것이 입증되었다.
의미 있는 오믹스 데이터를 생성하기 위한 시료 전처리에서 신중한 품질 관리가 중요하다는 것은 잘 알려져 있다42. 그러나, 앞서 기술한 바와 같이,11, 이러한 연구를 위한 리소겐 배양의 제조에서 프로파지 활성의 신중한 특성화는 거의 수행되지 않는다. 여기에서는 박테리아와 온대 파지 간의 상호 작용을 더 잘 탐구하기 위해 전사체 연구를 위해 잘 제어되고 최적화된 배양 세트를 준비하기 위한 체계적인 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 개체군의 동시성은 유도 항생제인 노르플록사신(norfloxacin)으로 치료하기 전에 배양을 최소 4배로 늘림으로써 제어되었습니다. 연구에서 균주에 대한 노르플록사신의 MIC를 결정함으로써 유도제의 농도가 “유도” 처리를 위한 MIC 바로 위에 있는지 확인할 수 있었습니다. 그런 다음 처리된 세포를 1:10으로 희석하여 1시간 처리 후 노르플록사신 농도를 MIC 이하로 낮추어 세포가 회복되고 파지 복제 과정을 완료하여 세포의 용해 및 감염성 파지 자손의 방출로 끝납니다. 세포는 회복 기간 동안 노르플록사신의 농도가 MIC 아래로 내려간 후에만 유도 자극 후 용해 복제 주기에 들어갑니다. 이 경우 PAO1에 대한 노르플록사신의 MIC가 0.19μg·mL-1이므로 1μg·mL-1 노르플록사신을 초과하면 약물을 MIC 이하로 효과적으로 희석할 수 없습니다. 유도제 희석 수준은 라이소겐 회수 필요성 및 RNA 수확을 위한 배양 밀도 유지와 균형을 이루어야 합니다. 여기에서 논의된 데이터는 배양을 동기화하여 lysogeny가 우세한 샘플을 생성함으로써 자발적 유도로 인한 노이즈를 줄이고 유전자 발현에서 진정한 lysogeny에 의한 변화를 검출할 수 있음을 보여줍니다. 박테리아 세포 밀도가 낮을 때 성장의 초기 기하급수적 단계에서 용원 상태가 우세하기 때문에 RNA-Seq와 같은 후속 유전자 발현 연구를 위해 충분한 RNA를 수확할 수 있도록 배양을 확대하는 것이 좋습니다.
배양을 용해 회로로 강제하기 위한 유도제로서 노르플록사신의 사용은 잘 보고되어 있다43,44; 그러나, 이것은 또한 과정에서의 다른 박테리아 유전자의 발현에 영향을 미칠 것이다(45,46). 이를 완화하기 위해 동일한 유도 및 비유도 조건에서 성장한 대조군 야생형 배양의 RNA 라이브러리를 RNA-Seq 실험에 포함해야 합니다. qRT-PCR에 의한 파지 복제 단계를 검증하기 위해 내부 대조군 및 주요 마커 유전자를 사용하는 것도 정확한 비교를 위해 중요합니다. 정량적 RT-PCR 프로파일링은 다양한 시점에서 각 유전자에 대한 전사체의 절대 수를 비교하여 해석할 수 없습니다. 중요한 것은 프로파일의 모양입니다. 첫째, 어떤 유전자에 대한 전사체의 작은 영역 하나만 샘플링되었기 때문에, 그것이 수명이 짧은 요소인지 아니면 수명이 긴 요소인지는 알 수 없다27. 확실히, 전사체의 RNA-Seq 매핑은 매핑 데이터의 밀도가 유전자의 길이에 따라 크게 변한다는 것을 보여줍니다. 둘째, 용해 주기 또는 용원 생활 방식과 관련된 마커 유전자에 대해 해석되어야 하거나 심지어 파지 조절 회로(11)로부터 분리되어야 하는 것은 유전자 발현 프로파일의 모양이다. 자발적 유도는 라이소겐 배양에서 실질적인 문제이며 항상 용해 주기 관련 유전자의 발현을 초래합니다. 그러나, 프로파일링은 용해 복제 주기와 관련된 유전자가 발현 전 유도(최소 2개의 로그 폴드) 및 상향 조절된 유도 후에서 억제됨을 보여줍니다.
이전에 수행된 Stx 파지와 대장균의 상호작용에 대한 전사체 분석은 용해를 유지하고 용해 회로를 유발하는 데 관여하는 파지 유전자에 대한 철저한 이해를 뒷받침한다11,17. 현재 녹농균(P. aeruginosa)의 LES 파지에는 주석이 달렸지만, 주요 유전자 기능은 잘 알려져 있지 않습니다. 전사체 연구는 LES 프로파지의 재주석을 가능하게 하고 용해 및 용해 주기에 관여하는 유전자에 대한 이해를 향상시킬 것입니다. 유전자 염기서열을 기능에 연결하는 것은 새로운 프로파지 연구에서 중요한 도전이며, 이는 더 나은 주석 도구의 생산을 위해 파지 유전자 기능을 확인하기 위한 더 많은 연구의 필요성을 더욱 강조한다47. 이 비디오 기사에 자세히 설명된 프로토콜과 추가 품질 관리 조치의 광범위한 적용 및 적응은 다양한 프로파지 기능을 밝히고 주석 파이프라인을 개선하고 파지 및 박테리아 생물학에 대한 이해를 변화시키는 데 도움이 될 수 있습니다.
PAO1 | 6 | ||
LESB58 | 6 | ||
LES phages | Induced and purified from LESB58 using Norfloxacin. | This study | |
Lysogeny Broth (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
LB Agar | Merck | 1.10283.500 | |
Agar Agar | Fisher | A/1080/53 | |
Top Agar | 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave and use. | – | |
Rifampicin | Sigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use) | R3501 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher 1% (v/v) in water | 10060000 | |
Norfloxacin | Sigma (Stock: 25 mg/mL of 1% Glacial Acetic Acid-Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use;To avoid freeze thaw cycles, store as small aliquotes) | N9890 | |
Phenol saturated with citrate buffer pH 4.3 | Sigma | P-4682 | |
Molecular Biology grade Ethanol | Fisher | 16695992 | |
TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
Chloroform | Fisher | 11398187 | |
Isopropanol | Fisher | 17150576 | |
Nuclease-free H2O | Invitrogen | 10526945 | |
10X TURBO DNase | Ambion | AM1907 | |
Qubit RNA HS, BR Kit | Invitrogen | Q10210 | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
SuperScriptIII first strand synthesis kit | Invitrogen | 18080051 | |
PCR Reagents | Bioline Mytaq Red 2X | BIO-25043 | |
qPCR Reagents | Sensifast SYBR Hi Rox | BIO-92020 | |
PCR purification kit | Isolate II PCR and Gel Kit | BIO-52060 | |
TA cloning kit | TA Cloning Kit, with pCR 2.1 Vector, without competent cells | K202040 | |
StepOne Real Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4376600 |