Ce protocole permet de révéler l’impact des prophages sur leurs hôtes. Les cultures bactériennes sont synchronisées en utilisant les conditions qui soutiennent le mieux l’état lysogénique, limitant ainsi l’induction spontanée. La RT-qPCR distingue sans équivoque les gènes restreints aux prophages et ceux qui ne sont pas couplés au contrôle des phages de ceux qui sont exprimés pendant le cycle de réplication lytique.
Les phages tempérés se trouvent intégrés sous forme de prophages dans la majorité des génomes bactériens. Certains prophages sont cryptiques et fixés dans le chromosome bactérien, mais d’autres sont actifs et peuvent être déclenchés sous une forme réplicative soit spontanément, soit par exposition à des facteurs inducteurs. Les prophages sont généralement associés à la capacité de conférer la production de toxines ou d’autres traits associés à la virulence à leur cellule hôte. Des études plus récentes ont montré qu’ils peuvent jouer un rôle beaucoup plus important dans la modification de la physiologie de leurs hôtes. La technique décrite ici nous a permis d’étudier comment les prophages affectent l’expression des gènes chez la bactérie opportuniste Pseudomonas aeruginosa.
Dans ce travail, la croissance de la souche PAO1 de P. aeruginosa de type sauvage a été comparée à celle de lysogènes isogéniques porteurs de différentes combinaisons de prophages de la souche épidémique de Liverpool (LES) LESB58. Dans une culture de lysogène, une proportion de cellules bactériennes soutiendra la réplication des bactériophages lytiques (induction spontanée) avec un niveau élevé d’expression par cellule des gènes tardifs des phages, tels que ceux associés à l’assemblage des particules de phages, masquant ainsi l’expression génique de faible niveau associée à l’expression des gènes restreints aux lysogènes. L’impact de l’induction spontanée peut donc masquer l’expression du gène du prophage dans une population de lysogènes.
Des expériences de profilage de croissance ont été utilisées pour identifier l’induction spontanée, qui était minime au début de la phase de croissance exponentielle. Cette étude explique comment préparer des cultures d’échantillons au début de la phase de croissance exponentielle et comment mettre en place des contrôles adéquats malgré un faible nombre de cellules. Ces protocoles assurent la comparaison fiable et reproductible des bactéries de type sauvage et lysogéniques dans diverses conditions, améliorant ainsi le profilage transcriptomique des génomes de prophages et aidant à l’identification de fonctions de prophages jusqu’alors inconnues.
Récemment, la phagothérapie pour lutter contre la résistance aux antimicrobiens1 et l’édition génomique basée sur CRISPR-Cas2 ont suscité un regain d’intérêt pour la recherche sur les bactériophages. Là encore, les progrès de la biotechnologie ont permis d’étudier plus en profondeur les interactions entre les bactéries et les phages3. Cependant, l’utilisation thérapeutique des phages (« phagothérapie ») est entravée par les préoccupations concernant les phages agissant comme des éléments génétiques mobiles ayant la capacité de transférer horizontalement les gènes de virulence et de résistance4. L’étendue de la « matière noire »5 (gènes aux fonctions inconnues) est à la fois troublante et séduisante. La matière noire est considérée comme une lacune dans notre compréhension de la biologie des phages et une ressource largement inexploitée pour les outils moléculaires et les nouvelles thérapies potentielles6. Le développement de techniques de séquençage à haut débit, ainsi que l’amélioration de l’annotation des gènes 7,8,9 et de nouveaux algorithmes de repliement peptidique10, améliorent la détection, la description et la prédiction fonctionnelle des gènes des phages. Cependant, la science est encore loin de valider les fonctions génétiques de la plupart des phages en culture ou dans le monde réel.
Le séquençage de l’ARN (RNA-Seq) permet de cartographier globalement l’expression des gènes au cours de l’infection par les phages et a considérablement amélioré la compréhension des phages et des éléments bactériens impliqués dans les cycles lytiques et lysogéniques11,12. Au cours des processus lysogéniques, les génomes des phages tempérés sont intégrés à l’ADN bactérien pour devenir des prophages13. Des expériences de profilage global de l’expression génique peuvent être utilisées pour identifier les gènes restreints aux prophages qui sont codés sur les génomes des phages tempérés mais qui ne sont exprimés qu’à l’état lysogénique11. Ces gènes ne codent pas pour les protéines structurales des phages et ne sont impliqués dans aucun processus d’infection par les phages. Le séquençage de l’ARN peut être utilisé pour identifier les gènes les plus susceptibles d’influencer la biologie de l’hôte bactérien, soit en induisant un gain de fonction, soit en régulant les gènes bactériens existants, permettant ainsi souvent aux bactéries de s’adapter à des environnements changeants. Par conséquent, la capacité des prophages à agir comme des marionnettistes microbiens, contrôlant une gamme de fonctions bactériennes, pourrait être étudiée.
Il existe deux obstacles majeurs à l’analyse efficace de l’expression des gènes restreints aux prophages. Tout d’abord, la disponibilité d’hôtes sensibles est une question clé. Par définition, les prophages sont déjà incorporés dans le génome spécifique de leur hôte, il est donc difficile de trouver un hôte de type sauvage susceptible de comparer l’expression globale du gène en présence et en absence du prophage. Cela peut être réalisé soit par l’infection de novo d’un autre hôte sensible, soit par la suppression du prophage de l’isolat de type sauvage d’origine, sans perturber le reste du génome de l’hôte. Le deuxième obstacle réside dans la nature hétérogène des populations lysogéniques. Certains prophages se dégradent par mutation ou recombinaison pour devenir « cryptiques », c’est-à-dire qu’ils sont fixés à un endroit spécifique du génome bactérien. Cependant, d’autres prophages sont « actifs » et peuvent être induits dans un cycle lytique réplicatif spontanément ou après exposition à des facteurs inducteurs. Dans de nombreuses cultures lysogéniques, le taux d’induction spontanée signifie qu’une partie des cellules bactériennes subissent toujours une réplication lytique des phages14,15,16. Un niveau élevé d’expression des gènes tardifs des phages dans ces populations masque l’expression génique de faible niveau associée à l’expression génique restreinte aux lysogènes11,17. La proportion de lysogènes subissant une induction spontanée de prophage peut varier en fonction de l’état de croissance, des conditions de croissance ou d’autres déclencheurs. Par conséquent, pour étudier les impacts des prophages sur le lysogène, les événements spontanés d’induction des prophages doivent être minimisés autant que possible en optimisant les conditions de croissance pour favoriser l’état lysogène.
Cette étude rend compte des travaux préparatoires effectués pour étudier l’influence d’un ensemble de prophages cohabitants de la souche épidémique de Liverpool (LES) de Pseudomonas aeruginosa. Des prophages actifs ont été induits et isolés à partir de LES et utilisés pour infecter la souche hôte modèle de P. aeruginosa, PAO116,18,19. Les génomes entiers de la souche sauvage de P. aeruginosa, PAO1, et de son lysogène, PAO1Φ2, ont été séquencés (à une profondeur de couverture de 30x) pour assurer l’identité de la souche de type sauvage et confirmer que le lysogène était isogène. Le LES a été associé à une augmentation de la morbidité et de la mortalité chez les patients atteints de fibrose kystique, et il a été suggéré que les phages LES 19 aident à l’adaptation à l’environnement pulmonaire de la fibrose kystique16,19,20. Malgré des preuves solides que ces prophages affectent la biologie de leur hôte20,21, la majorité de leurs fonctions génétiques n’ont pas encore été caractérisées et les mécanismes spécifiques d’interaction sont mal compris. Une approche transcriptomique permet de découvrir empiriquement les fonctions des gènes prophages dans un contexte hôte contrôlé. Étant donné que l’induction spontanée peut affecter les profils d’expression, cet article décrit comment optimiser les conditions de croissance pour favoriser l’état lysogène. Une telle synchronisation des cultures peut être validée par PCR en temps réel pour quantifier les niveaux d’expression des marqueurs génétiques clés associés aux étapes cruciales de la réplication des phages LES dans PAO1. La même approche a déjà été utilisée pour identifier les fonctions restreintes aux prophages des phages shiga-toxinogènes qui affectent la motilité, la résistance à l’acide et la résistance aux antimicrobiens chez Escherichia coli11,17,21,22.
La création d’un hôte indicateur sélectionnable, précédemment utilisé dans les tests de plaque pour quantifier plus précisément l’induction spontanée du phage Stx à partir de E. coli MC1061 37,38,39, a été décrite ici pour le phage LESΦ2 de P. aeruginosa. Cette intervention a l’avantage supplémentaire de réduire les étapes et le temps de traitement de l’échantillon, permettant ainsi l’évaluation simultanée des taux d’induction spontanée dans plusieurs conditions de culture. Il existe un risque de générer d’autres mutations lors de la création de variants résistants à la rifampicine40 ; Cependant, dans ce travail, la souche évoluée n’a été utilisée que comme hôte indicateur pour le dénombrement des plaques provenant de cultures d’intérêt et n’a pas été incluse dans l’analyse transcriptomique. Tant que la souche indicatrice sélectionnable reste également sensible à l’infection par le phage d’intérêt, il n’y a pas lieu de s’inquiéter des autres mutations acquises. Néanmoins, aucune différence dans les profils de polymorphisme de longueur des fragments de restriction n’a été détectée par l’analyse par électrophorèse sur gel en champ pulsé (PFGE) de PAO1WT et PAO1RIF (données non présentées).
Lors du choix des cellules hôtes, il est rare de trouver une souche indicatrice qui n’héberge pas déjà des prophages. À titre d’exemple, PAO1 héberge le prophage filamenteux Pf4. Les témoins expérimentaux de cette étude ont été conçus pour être en mesure d’examiner directement l’expression génique de phages spécifiques (dans ce cas, le prophage LES 2) et les effets de ce phage sur l’expression des gènes bactériens. Dans la comparaison des transcrits de PAO1 porteurs du prophage LES 2 et dépourvus du prophage LES 2 (les lysogènes et les non-lysogènes portent le Pf4 endogène), qui servent de contrôles internes pour exclure l’impact de Pf4 sur l’hôte. De plus, il a été démontré que Pf4 ne provoque généralement pas de lyse dans sa cellule hôte41 et n’est donc pas capable de confondre les résultats de ces expériences.
Il est bien établi qu’un contrôle minutieux de la qualité est crucial dans la préparation des échantillons pour produire des données omiques significatives42. Cependant, comme nous l’avons déjà décrit11, la caractérisation minutieuse de l’activité des prophages dans la préparation de cultures de lysogène pour de telles études est rarement effectuée. Ici, nous détaillons nos protocoles systématiques pour la préparation d’un ensemble de cultures bien contrôlées et optimisées pour les études transcriptomiques afin de mieux explorer les interactions entre les bactéries et les phages tempérés. La synchronicité de la population a été contrôlée en faisant passer la culture par au moins quatre doublements avant de la traiter avec l’antibiotique inducteur norfloxacine. En déterminant la CMI de la norfloxacine pour la souche de l’étude, nous avons pu nous assurer que la concentration de l’agent inducteur était juste au-dessus de la CMI pour le traitement « d’induction ». Les cellules traitées ont ensuite été diluées à 1 :10 pour abaisser la concentration de norfloxacine en dessous de la CMI après le traitement de 1 h afin de permettre aux cellules de récupérer et de compléter le processus de réplication des phages, se terminant par la lyse de la cellule et la libération de la progéniture des phages infectieux. Les cellules n’entrent dans le cycle de réplication lytique après le stimulus d’induction qu’une fois que la concentration de norfloxacine a été amenée en dessous de la CMI pendant la période de récupération. Dans ce cas, dépasser 1 μg·mL−1 norfloxacine signifie que le médicament ne pourrait pas être dilué efficacement en dessous de la CMI, car la CMI de la norfloxacine pour la PAO1 est de 0,19 μg·mL−1. Le niveau de dilution de l’inducteur doit être équilibré avec la nécessité de récupérer le lysogène et de conserver la densité de culture pour la récolte de l’ARN. Les données discutées ici démontrent qu’il est possible de synchroniser les cultures pour créer des échantillons dans lesquels la lysogénie domine, réduisant ainsi le bruit de l’induction spontanée et permettant la détection de véritables changements induits par la lysogénie dans l’expression des gènes. Étant donné que l’état lysogénique est prédominant dans la phase de croissance exponentielle précoce lorsque la densité cellulaire bactérienne est faible, nous suggérons de mettre à l’échelle les cultures afin de récolter suffisamment d’ARN pour les études ultérieures d’expression génique telles que le séquençage de l’ARN.
L’utilisation de la norfloxacine comme agent inducteur pour forcer les cultures à entrer dans le cycle lytique est bien rapportée43,44 ; Cependant, cela affectera également l’expression d’autres gènes bactériens dans le processus45,46. Pour atténuer ce phénomène, des banques d’ARN provenant de cultures de type sauvage de contrôle cultivées dans les mêmes conditions inductrices et non inductrices doivent être incluses dans les expériences de séquençage de l’ARN. L’utilisation de contrôles internes et de gènes marqueurs clés pour valider les étapes de la réplication des phages par qRT-PCR est également cruciale pour des comparaisons précises. Le profilage quantitatif par RT-PCR ne peut pas être interprété en comparant le nombre absolu de transcrits pour chaque gène à différents moments ; C’est la forme du profil qui compte. Tout d’abord, une seule petite région dans le transcrit d’un gène a été échantillonnée, de sorte qu’on ne sait pas s’il s’agit d’un élément à courte ou à plus longue durée de vie27. Certes, la cartographie RNA-Seq des transcrits montre que la densité des données de cartographie varie considérablement sur la longueur d’un gène. Deuxièmement, c’est la forme du profil d’expression génique qui doit être interprétée pour un gène marqueur associé au cycle lytique ou au mode de vie lysogénique ou même découplé des circuits de régulation des phages11. L’induction spontanée est un réel problème dans la culture des lysogènes et se traduira toujours par l’expression de gènes associés au cycle lytique. Cependant, le profilage montre que les gènes associés au cycle de réplication lytique sont supprimés dans leur expression avant l’induction (au moins deux plis logarithmiques) et régulés à la hausse après l’induction.
Les analyses transcriptomiques précédemment effectuées sur les interactions des phages Stx avec E. coli permettent une compréhension approfondie des gènes des phages impliqués dans le maintien de la lysogénie et le déclenchement du cycle lytique11,17. À l’heure actuelle, les phages LES de P. aeruginosa ont été annotés, mais leurs fonctions génétiques clés sont moins bien comprises. Les études transcriptomiques permettront de réannoter les prophages LES et d’améliorer notre compréhension des gènes impliqués dans la lysogénie et le cycle lytique. Relier la séquence des gènes à la fonction représente un défi majeur dans l’étude de nouveaux prophages, ce qui souligne la nécessité de poursuivre les études pour confirmer les fonctions des gènes des phages afin de produire de meilleurs outils d’annotation47. L’application et l’adaptation plus larges des protocoles et des mesures de contrôle de la qualité supplémentaires détaillées dans cet article vidéo pourraient aider à dévoiler diverses fonctions des prophages et, par conséquent, à améliorer les pipelines d’annotation et à transformer notre compréhension de la biologie des phages et des bactéries.
PAO1 | 6 | ||
LESB58 | 6 | ||
LES phages | Induced and purified from LESB58 using Norfloxacin. | This study | |
Lysogeny Broth (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
LB Agar | Merck | 1.10283.500 | |
Agar Agar | Fisher | A/1080/53 | |
Top Agar | 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave and use. | – | |
Rifampicin | Sigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use) | R3501 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher 1% (v/v) in water | 10060000 | |
Norfloxacin | Sigma (Stock: 25 mg/mL of 1% Glacial Acetic Acid-Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use;To avoid freeze thaw cycles, store as small aliquotes) | N9890 | |
Phenol saturated with citrate buffer pH 4.3 | Sigma | P-4682 | |
Molecular Biology grade Ethanol | Fisher | 16695992 | |
TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
Chloroform | Fisher | 11398187 | |
Isopropanol | Fisher | 17150576 | |
Nuclease-free H2O | Invitrogen | 10526945 | |
10X TURBO DNase | Ambion | AM1907 | |
Qubit RNA HS, BR Kit | Invitrogen | Q10210 | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
SuperScriptIII first strand synthesis kit | Invitrogen | 18080051 | |
PCR Reagents | Bioline Mytaq Red 2X | BIO-25043 | |
qPCR Reagents | Sensifast SYBR Hi Rox | BIO-92020 | |
PCR purification kit | Isolate II PCR and Gel Kit | BIO-52060 | |
TA cloning kit | TA Cloning Kit, with pCR 2.1 Vector, without competent cells | K202040 | |
StepOne Real Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4376600 |