このプロトコルにより、宿主に対するプロファージの影響を明らかにすることができます。細菌培養は、溶解原性状態を最もよくサポートする条件を使用して同期され、自発的な誘導が制限されます。RT-qPCRは、増殖抑制遺伝子およびファージ制御から切り離された遺伝子を、溶解性複製サイクル中に発現する遺伝子と明確に区別します。
温帯性ファージは、細菌ゲノムの大部分にプロファージとして組み込まれていることがわかっています。一部のプロファージは不可解で細菌の染色体に固定されていますが、他のプロファージは活性であり、自発的に、または誘導因子への曝露によって複製形態に引き起こされる可能性があります。プロファージは一般に、宿主細胞に毒素産生やその他の病原性関連形質を付与する能力と関連しています。最近の研究では、宿主の生理機能を変化させる上で、はるかに大きな役割を果たすことができることが示されています。今回紹介した手法により、プロファージが日和見細菌 である緑膿菌の遺伝子発現にどのような影響を与えるかを調べることができました。
この研究では、野生型の 緑膿菌 PAO1株の増殖を、リバプール流行株(LES)LESB58のプロファージの異なる組み合わせを運ぶ同原性溶解原の増殖と比較しました。溶解原体培養では、細菌細胞の一部が溶解性バクテリオファージ複製(自発的誘導)をサポートし、ファージ粒子の組み立てに関連するものなど、後期ファージ遺伝子の細胞あたりの高レベルの発現をサポートし、溶解原体制限遺伝子発現に関連する低レベルの遺伝子発現をマスクします。したがって、自発的誘導の影響により、ライソゲン集団全体の増殖遺伝子発現が不明瞭になる可能性があります。
成長プロファイリング実験は、指数関数的成長の初期には最小限であった自発的誘導を特定するために使用されました。この研究では、指数関数的増殖の初期にサンプル培養を調製する方法と、細胞数が少ないにもかかわらず適切なコントロールを設定する方法を報告しています。これらのプロトコルは、さまざまな条件下での野生型細菌と溶解原性細菌の信頼性と再現性のある比較を保証し、プロファージゲノムのトランスクリプトームプロファイリングを改善し、これまで認識されていなかったプロファージ機能の同定を支援します。
近年、薬剤耐性1やCRISPR-Casを用いた遺伝子編集2に取り組むファージセラピーが、バクテリオファージ研究に新たな関心を寄せています。繰り返しになりますが、バイオテクノロジーの進歩により、バクテリアとファージの相互作用をより深く調べることが可能になりました3。しかし、ファージの治療的使用(「ファージ療法」)は、病原性および耐性遺伝子を水平方向に伝達する能力を持つ移動性遺伝要素として作用するファージに関する懸念によって妨げられている4。「暗黒物質」5(機能不明の遺伝子)の広がりは、厄介であると同時に魅力的でもあります。暗黒物質は、ファージ生物学の理解におけるギャップであり、分子ツールや潜在的な新規治療法のほとんど未開発のリソースであると考えられています6。改良された遺伝子アノテーション7,8,9および新しいペプチドフォールディングアルゴリズム10とともに、ハイスループット配列決定技術の開発は、ファージ遺伝子の検出、記述、および機能予測を改善している。しかし、科学は、培養や現実の世界におけるほとんどのファージの遺伝子機能を検証するには、まだほど遠い状態です。
RNAシーケンシング(RNA-Seq)は、ファージ感染中の遺伝子発現をグローバルにマッピングすることができ、溶解サイクルと溶解サイクルに関与するファージと細菌の両方の要素の理解を大幅に向上させました11,12。溶解過程において、温帯性ファージゲノムは細菌DNAに組み込まれ、プロファージとなる13。グローバルな遺伝子発現プロファイリング実験は、温帯ファージゲノムにコードされているが、溶解原性状態の間にのみ発現するプロファージ制限遺伝子を同定するために用いることができる11。このような遺伝子は、ファージ構造タンパク質をコードしておらず、ファージ感染プロセスに関与していません。RNA-Seqは、機能獲得を誘導したり、既存の細菌遺伝子を制御したりすることで、細菌宿主の生物学に影響を与える可能性が高い遺伝子を特定するために使用でき、多くの場合、細菌が変化する環境に適応できるようにします。したがって、プロファージが微生物の操り人形として行動し、さまざまな細菌機能を制御する能力を研究することができます。
プロファージ制限遺伝子発現の効果的な解析には、2つの大きな障壁があります。まず、影響を受けやすいホストの可用性が重要な問題です。定義上、プロファージはすでに特定の宿主ゲノムに組み込まれているため、プロファージの存在下と非存在下で全体的な遺伝子発現を比較するために感受性野生型宿主を見つけることは困難です。これは、宿主ゲノムの残りの部分を破壊することなく、別の感受性宿主のde novo感染または元の野生型分離株からのプロファージの欠失のいずれかによって達成できます。第2の障壁は、溶解原性集団の不均一性にあります。一部のプロファージは、突然変異や組換えによって分解され、細菌ゲノムの特定の場所に固定される「隠れた」状態になります。しかし、他のプロファージは「活性」であり、自発的に、または誘導因子への曝露後に、複製性の溶解サイクルに誘導される可能性があります。多くの溶解原性培養では、自発的誘導の速度は、細菌細胞の一部が常に溶解性ファージ複製を受けていることを意味します14,15,16。これらの集団における後期ファージ遺伝子の高レベルの発現は、リソゲン制限遺伝子発現に関連する低レベルの遺伝子発現を覆い隠す11,17。自発的な増殖誘導を受けるリソゲンの割合は、増殖状態、増殖条件、またはその他のトリガーによって変化し得る。したがって、プロファージが溶解原体に及ぼす影響を研究するには、溶解原性状態に有利なように増殖条件を最適化することにより、自発的なプロファージ誘導イベントを可能な限り最小限に抑える必要があります。
この研究は、緑膿菌のリバプール流行株(LES)からの一連の同生プロファージの影響を調査するために行われた準備作業を報告します。活性プロファージを誘導し、LESから単離し、モデル緑膿菌宿主株PAO116,18,19に感染させた。野生型緑膿菌株PAO1とその溶解原体PAO1Φ2の全ゲノムを(30倍の深さで)配列決定し、野生型株の同一性を確保し、溶解原が同質であることを確認しました。LESは、嚢胞性線維症患者の罹患率および死亡率の増加と関連しており、LESファージ19は、嚢胞性線維症の肺環境への適応を助けることが示唆されている16,19,20。これらのプロファージが宿主の生物学に影響を与えるという強力な証拠にもかかわらず20,21、それらの遺伝子機能の大部分は未だに特徴付けられておらず、相互作用の具体的なメカニズムは十分に理解されていません。トランスクリプトミクスのアプローチは、制御された宿主バックグラウンドにおけるプロファージ遺伝子の機能を経験的に明らかにすることができます。自発的誘導は発現プロファイルに影響を与える可能性があるため、本稿では、溶解原性状態を優先するように増殖条件を最適化する方法について説明します。このような培養の同期は、PAO1におけるLESファージ複製の重要な段階に関連する主要な遺伝子マーカーの発現レベルを定量化するために、リアルタイムPCRによって検証することができます。同じアプローチは、大腸菌11,17,21,22の運動性、耐酸性、および抗菌性耐性に影響を与える志賀毒素原性ファージのプロファージ制限機能を同定するために以前に使用されていました。
緑膿菌MC106137,38,39からのStxファージの自発的誘導をより正確に定量化するためにプラークアッセイで以前に使用された選択可能な指標宿主の作成は、緑膿菌ファージLESΦ2についてここに記載されています。この介入には、サンプル処理のステップと時間が短縮され、複数の培養条件での自発的な誘導率の同時評価が可能になるという利点もあります。リファンピシン耐性変異体の作成中に他の変異を生じさせるリスクがある40。ただし、この研究では、進化した株は、目的の培養物からのプラークを列挙するための指標宿主としてのみ使用され、トランスクリプトーム分析には含まれていませんでした。選択可能な指標株が目的のファージによる感染に対して等しく感受性である限り、他の後天性変異についての懸念はありません。それにもかかわらず、PAO1WTおよびPAO1RIFのパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)分析では、制限フラグメント長多型プロファイルに差は検出されませんでした(データは示していません)。
宿主細胞を選択する際、まだ増殖物を保有していない指標株を見つけることはまれです。その好例として、PAO1は糸状のプロファージPf4を保有しています。この研究の実験的コントロールは、特定のファージ(この場合はLESプロファージ2)の遺伝子発現と、このファージが細菌の遺伝子発現に及ぼす影響を直接調べることができるように設計されています。LESプロファージ2を保有するPAO1とLESプロファージ2を欠損するPAO1(リゾゲンと非リソゲンの両方が内因性Pf4を保有)の比較では、宿主に対するPf4の影響を排除するための内部コントロールとして機能します。さらに、Pf4は通常、その宿主細胞41 において溶解を引き起こさず、したがって、これらの実験の結果を混乱させることができないことが実証されている。
有意義なオミクスデータを生成するためのサンプル調製において、慎重な品質管理が重要であることは十分に確立されている42。しかしながら、前述したように11、そのような研究のためのリゾゲン培養物の調製におけるプロファージ活性の慎重な特性評価はめったに行われない。ここでは、細菌と温帯ファージの相互作用をよりよく探索するために、トランスクリプトーム研究のために適切に制御され最適化された培養セットを調製するための体系的なプロトコルについて詳しく説明します。個体群の同期性は、抗生物質ノルフロキサシンを誘発して処理する前に、少なくとも4回の倍増によって培養物を持ち込むことによって制御されました。研究中の菌株のノルフロキサシンのMICを決定することにより、誘導剤の濃度が「誘導」治療のMICをわずかに上回っていることを確認できます。処理された細胞は、細胞が回復し、バクテリオファージ複製プロセスを完了し、細胞の溶解と感染性バクテリオファージ子孫の放出で終わるようにするために、1時間の処理後にMICの下でノルフロキサシン濃度を下げるために1:10を希釈しました。細胞はnorfloxacinの集中が回復期間の間にMICの下に持って来られた後だけ誘導の刺激に続く溶解性の複製周期に入ります。この場合、1 μg·mL-1ノルフロキサシンを超えることは、PAO1のノルフロキサシンのMICが0.19 μg·mL-1であるため、薬物がMICの下で効果的に希釈できなかったことを意味します。インデューサーの希釈レベルは、リゾゲン回収の必要性とRNAを回収するための培養密度の保持とのバランスをとる必要があります。ここで取り上げたデータは、培養を同期させてライソジェニーが優勢なサンプルを作製することで、自然誘導によるノイズを低減し、ライソジェニーによる遺伝子発現の真の変化を検出できることを実証しています。細菌細胞密度が低い指数関数的増殖初期では溶解原性状態が優勢であるため、RNA-Seqなどのその後の遺伝子発現研究に十分なRNAを収穫するために培養をスケールアップすることをお勧めします。
培養物を溶解サイクルに強制するための誘導剤としてのノルフロキサシンの使用は、よく報告されています43,44。しかし、これはプロセスにおける他の細菌遺伝子の発現にも影響を与えるであろう45,46。これを軽減するには、同じ誘導条件と非誘導条件で増殖させた対照野生型培養由来のRNAライブラリーをRNA-Seq実験に含める必要があります。qRT-PCRによるファージ複製の段階を検証するための内部コントロールとキーマーカー遺伝子の使用も、正確な比較のために重要です。定量的RT-PCRプロファイリングは、さまざまな時点での各遺伝子の転写産物の絶対数を比較することによって解釈することはできません。重要なのはプロファイルの形状です。第一に、どの遺伝子の転写産物でも1つの小さな領域しかサンプリングされていないため、それが短命な要素なのか、より長い寿命の要素なのかは不明です27。確かに、転写産物のRNA-Seqマッピングは、マッピングデータの密度が遺伝子の長さにわたって大きく変化することを示しています。第二に、溶解周期または溶解原性ライフスタイルに関連するマーカー遺伝子について解釈されるべき、あるいはファージ調節回路から切り離されたマーカー遺伝子について解釈されるべきであるのは、遺伝子発現プロファイルの形状である11。自然誘導は、ライソゲン培養における真の問題であり、常に溶解周期関連遺伝子の発現をもたらします。しかし、プロファイリングは、溶解性複製サイクルに関連する遺伝子が、その発現前誘導(少なくとも2つの対数フォールド)で抑制され、誘導後にアップレギュレーションされることを示しています。
Stxファージと大腸菌との相互作用のトランスクリプトーム解析は、溶解性の維持と溶解サイクルの引き金となるファージ遺伝子の完全な理解を裏付けている11,17。現在、緑膿菌のLESファージにアノテーションが付けられているが、その重要な遺伝子機能はあまりよくわかっていない。トランスクリプトーム研究により、LESプロファージの再アノテーションが可能になり、溶解と溶解サイクルに関与する遺伝子の理解が深まります。遺伝子配列を機能に結びつけることは、新規プロファージの研究における大きな課題であり、より良いアノテーションツールを製造するために、ファージ遺伝子の機能を確認するためのさらなる研究の必要性をさらに強調している47。このビデオ記事で詳述されているプロトコルのより広範な適用と適応、および追加の品質管理手段は、さまざまなプロファージ機能を明らかにするのに役立ち、したがって、アノテーションパイプラインを改善し、ファージと細菌の生物学の理解を変革する可能性があります。
PAO1 | 6 | ||
LESB58 | 6 | ||
LES phages | Induced and purified from LESB58 using Norfloxacin. | This study | |
Lysogeny Broth (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
LB Agar | Merck | 1.10283.500 | |
Agar Agar | Fisher | A/1080/53 | |
Top Agar | 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave and use. | – | |
Rifampicin | Sigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use) | R3501 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher 1% (v/v) in water | 10060000 | |
Norfloxacin | Sigma (Stock: 25 mg/mL of 1% Glacial Acetic Acid-Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use;To avoid freeze thaw cycles, store as small aliquotes) | N9890 | |
Phenol saturated with citrate buffer pH 4.3 | Sigma | P-4682 | |
Molecular Biology grade Ethanol | Fisher | 16695992 | |
TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
Chloroform | Fisher | 11398187 | |
Isopropanol | Fisher | 17150576 | |
Nuclease-free H2O | Invitrogen | 10526945 | |
10X TURBO DNase | Ambion | AM1907 | |
Qubit RNA HS, BR Kit | Invitrogen | Q10210 | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
SuperScriptIII first strand synthesis kit | Invitrogen | 18080051 | |
PCR Reagents | Bioline Mytaq Red 2X | BIO-25043 | |
qPCR Reagents | Sensifast SYBR Hi Rox | BIO-92020 | |
PCR purification kit | Isolate II PCR and Gel Kit | BIO-52060 | |
TA cloning kit | TA Cloning Kit, with pCR 2.1 Vector, without competent cells | K202040 | |
StepOne Real Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4376600 |