Um estoque congelado pronto para uso de neurônios é uma ferramenta poderosa para avaliar as funções sinápticas. Aqui, apresentamos uma cultura primária fácil de baixa densidade a partir de estoque congelado usando uma placa de 96 poços.
A cultura neuronal é um sistema valioso para avaliar as funções sinápticas e os exames de drogas. Em particular, uma cultura de baixa densidade de neurônios primários do hipocampo permite o estudo de neurônios individuais ou componentes subcelulares. Mostramos a localização de proteínas subcelulares dentro de um neurônio por imunocitoquímica, polaridade neuronal, morfologia sináptica e sua mudança de desenvolvimento usando uma cultura hipocampal primária de baixa densidade. Recentemente, estoques congelados prontos para uso de neurônios tornaram-se comercialmente disponíveis. Esses estoques congelados de neurônios reduzem o tempo necessário para preparar experimentos com animais e também contribuem para a redução do número de animais usados. Aqui, apresentamos um método de cultura primária de baixa densidade reprodutível usando uma placa de 96 poços. Usamos um estoque congelado comercialmente disponível de neurônios do hipocampo embrionário de ratos. Os neurônios podem ser cultivados de forma estável a longo prazo, sem alterações na mídia, reduzindo o crescimento de células gliais em determinados pontos de tempo. Este ensaio de alto rendimento usando cultura de baixa densidade permite avaliações reprodutíveis baseadas em imagens da plasticidade sináptica.
O desenvolvimento de um sistema experimental in vitro que possa avaliar as funções sinápticas envolvidas na aprendizagem e na memória é importante. A cultura neuronal é um sistema valioso para avaliar as funções sinápticas in vitro. A técnica de cultura neuronal foi utilizada pela primeira vez na década de 1980 e, na década de 1990, desenvolveu-se a cultura de baixa densidade de neurônios primários do hipocampo 1,2,3 para o estudo de neurônios individuais em termos de localização subcelular de componentes proteicos, tráfico de proteínas, polaridade neuronal, morfologia da coluna, desenvolvimento de sinapses e plasticidade 4,5,6,7,8 . No entanto, existem muitas etapas envolvidas nesta técnica: acasalamento de animais, dissecação de embriões, preparação de vasos de cultura e cultura de células por 3 semanas com alterações de mídia uma vez por semana. Além disso, requer técnicas avançadas3.
Desenvolvemos estoques congelados de neurônios hipocampais dissociados de embriões de ratos 9,10. Os estoques congelados de neurônios estão prontos para uso, e não são necessárias técnicas avançadas para a cultura das células11,12. Em outras palavras, a cultura dos neurônios a partir de estoques congelados não depende da técnica de um experimentador. Ele elimina a necessidade de experimentos em animais (por exemplo, permissão para experimentos com animais, organização de animais prenhes cronometrados e dissecação de embriões de ratos), reduzindo assim o número de animais usados. Recentemente, estoques congelados de neurônios de alta qualidade e prontos para uso tornaram-se comercialmente disponíveis. Aqui, foram utilizados estoques congelados comercialmente disponíveis do hipocampo embrionário do dia (E) 18 de rato13,14,15. A cultura dos neurônios de um estoque congelado não requer meios condicionados pela glia ou co-cultura com células gliais. Meios de cultura primários comuns sem soro adicional podem ser usados para cultivar as células; portanto, podemos adquirir dados reprodutíveis. Além disso, não há necessidade de troca de meios por 3 semanas após a semeadura celular, pois o crescimento de células gliais é reduzido (Figura 1).
Os espinhos dendríticos são o compartimento pós-sináptico da maioria das sinapses excitatórias. Eles contêm proteínas receptoras, proteínas de andaime pós-sináptico e proteínas citoesqueléticas de actina. Focalizamos uma proteína dretrina ligadora de actina 5,6,7,16,17,18. A drebrina se acumula na cabeça da coluna vertebral em neurônios maduros19, e relatamos a drebrina como marcador do estado sináptico 15,17,20,21,22,23. Ao realizar uma análise de alto conteúdo usando dretrina como leitura, relatamos recentemente os efeitos inibitórios de análogos de fenciclidina em receptores de glutamato do tipo ácido N-metil-D-aspártico (NMDARs)10 e os efeitos dependentes de NMDAR de compostos naturais e drogas brutas em estados sinápticos15.
Aqui, detalhamos como cultivar estoques congelados de neurônios em baixa densidade. Além disso, mostramos uma avaliação baseada em imagens de drebrin do estado sináptico usando placas de 96 poços.
Um passo crítico neste método é descongelar a suspensão celular. A transferência da suspensão celular antes que ela se torne muito quente é muito importante. Para evitar a rápida mudança da osmolalidade, no entanto, não transfira a suspensão celular para um grande volume do meio de uma só vez. A adição gota a gota do meio de cultura também é crucial para evitar mudanças bruscas na pressão osmótica.
Os neurônios podem ser cultivados em outros vasos de cultura: placas de 24 poços, câmaras de 8 poços, placas de 60 mm ou sondas MED. Nesses casos, no entanto, a concentração final e o momento da adição de Ara-C precisam ser ajustados. Além disso, a densidade dos neurônios precisa ser otimizada em diferentes tipos de experimentos. Por exemplo, a cultura de alta densidade é necessária para experimentos eletrofisiológicos e, nesse caso, a troca de meios é necessária duas vezes por semana (Figura 6). Assim, uma cultura de baixa densidade requer menos etapas do que uma cultura de alta densidade.
A cultura neuronal de baixa densidade geralmente requer técnicas avançadas; no entanto, o uso de estoque congelado pronto para uso resolve esse problema. O método descrito não depende da habilidade de um experimentador. A qualidade do estoque congelado é estável e pode ser cultivada de forma estável, desde que sejam armazenados em nitrogênio líquido e evitem mudanças de temperatura por até 4 anos.
A cultura das células por 3 semanas sem troca de meio levanta a questão sobre se há mudanças significativas na osmolalidade ou evaporação do meio de cultura. No entanto, confirmamos que a evaporação do meio de cultura é pequena (taxa de redução de 3,6%). A localização das proteínas sinápticas e a morfologia dos neurônios parecem normais após 3 semanas. Portanto, a cultura de 3 semanas sem troca de mídia não causa grandes alterações de osmolalidade que afetam as condições dos neurônios cultivados. Manter a placa em uma incubadora após o tratamento com Ara-C também é um ponto importante que minimiza a evaporação.
Não há limitação quanto ao uso dos neurônios congelados. No entanto, existem algumas limitações do método de cultura de baixa densidade. Confirmamos que a cultura de baixa densidade poderia ser aplicada para observação morfológica de neurônios, avaliação da função sináptica e transfecção de GFP. No entanto, não examinamos imagens de células vivas. Além disso, como mencionado acima, a cultura de alta densidade é necessária para realizar a eletrofisiologia.
A maturação da sinapse normalmente leva 3 semanas7, e não podemos confirmar que os neurônios cultivados têm sinapses adequadas até o final. Se a maturação da sinapse não for boa após 3 semanas, teríamos que cultivar novamente. Conhecendo a qualidade dos neurônios antes de iniciar os experimentos, podemos salvar essas 3 semanas. Portanto, para realizar experimentos de forma eficiente, é melhor verificar a qualidade dos neurônios com antecedência. Os estoques congelados permitem verificar a qualidade dos neurônios de antemão. Cada lote de estoques congelados é gerado a partir de uma ninhada de ratos, e podemos usar um dos estoques de cada lote para uma verificação de qualidade. Drebrin é um bom marcador para a verificação de qualidade dos neurônios. Como descrito, a dretrina se acumula na cabeça da coluna vertebral em neurônios maduros e reage à estimulação sináptica. Assim, podemos verificar a qualidade dos neurônios em estoques congelados usando drebrin como marcador.
Este método pode ser aplicado para avaliar o efeito de drogas sobre o estado sináptico. O êxodo de drebrin dos espinhos dendríticos ocorre durante os estágios iniciais da plasticidade sináptica22. Portanto, a detecção da redução do cluster de drebrin provocada pelo tratamento medicamentoso mostra que a droga estimula a sinapse e causa plasticidade sináptica. Além disso, para identificar se a redução é dependente do NMDAR, um experimento usando ácido 2-amino-5-fosfonovalérico (APV, um antagonista do NMDAR) é útil. Usando a dretrina como marcador, mesmo uma dependência NMDAR é claramente determinada10,15. O método descrito é útil em exames de medicamentos, estudos farmacológicos de segurança e avaliação da função sináptica.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Kazumi Kamiyama e Manami Kawada pela assistência com os experimentos. Este trabalho foi apoiado pela JSPS KAKENHI (Grant Number 19K08010 to N.K.) e pela Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (Grant Number JP19bk0104077 e JP22bm0804024 to T.S.).
96 well plate | Zeon Corporation | Gifted | |
96 well plate | greiner | 655986 | |
Anti-drebrin antibody (M2F6) | MBL | D029-3 | Mouse monoclonal (dilution 1:1) |
Anti-MAP2 antibody | Millipore | AB5622 | Rabbit (dilution 1:1000) |
Anti-mouse Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11031 | Dilution 1: 500 |
Anti-rabbit Alexa Fluor | Thermo Fisher Scientific | A11008 | Dilution 1: 500 |
B-27 | Gibco | 17504-044 | 2 v/v% for MEA plates; 50x for normal plates |
Borax | Sigma | B-9876 | Final concentration 12 mM |
Boric acid | WAKO | 021-02195 | Final concentration 50 mM |
Bovine serum albumin | Millipore | 12659-100G | Final concentration: 3% in PBS |
Confocal quantitative image cytometer CellVoyager CQ1 |
YOKOGAWA | Phase contrast images | |
Cytosine β-D-arabino-furanoside (Ara-C) | Sigma | C-6645 | Diluted in dH2O (final concentration: 0.2 µM) |
DAPI | FUJIFILM | 340-07971 | Dilution 1:1000 |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 2.5 mM for MEA plates; 400x for normal plates |
In Cell Analyzer 2200 | Cytiva | Fluorescence images | |
Laminin | Sigma | 114956-81-9 | Final concentration: 20 µg/mL |
Maestro | Axion Biosystems | MEA recordings | |
MEA plate | Axion Biosystems | M768-tMEA-48W | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Paraformaldehyde | nacalai tesque | 26126-25 | Final concentration: 4% in PBS |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/mL for normal plates |
Penicillin/Streptomycin | nacalai tesque | 26253-84 | 100 µg/mL for MEA plates |
polyethyleimine | Sigma | 9002-98-6 | Final concentration: 0.1% |
Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | Diluted in the borate buffer (final concentration: 1 mg/mL) |
SKY Neuron | AlzMed , Inc. | ARH001 | 1.0 x 106 cells/tube |
Sodium azide | FUJIFILM | 195-11092 | 0.1% |
SodiumL(+)-Glutamate monohydrate | WAKO | 194-02032 | Diluted in dH2O (final concentrations: 1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM, 100 µM) |