В этом исследовании подробно описаны процедуры установления хронической травмы вращательной манжеты плеча (RC) кролика. В частности, повреждение создается в подлопаточной мышце/миотендозном отделе, чтобы имитировать анатомию и патофизиологию РК человека, включая тяжелую мышечно-жировую дегенерацию (ФД). Этот протокол может быть применен для изучения травм РК и оценки регенеративной терапии.
Патофизиология вращательной манжеты плеча кролика (RC) может привести к прогрессирующим и высокодегенеративным изменениям в связанной с ней мускулатуре и сухожилиях, что отрицательно влияет на клинически значимые параметры, такие как прочность и втягивание мышечно-сухожильного/миотендинного блока, что в конечном итоге приводит к потере функции плеча и отрицательно влияет на результаты восстановления RC. Животные модели, которые имитируют аспекты анатомии и патофизиологии РК человека, имеют решающее значение для продвижения концептуального понимания прогрессирования травмы и разработки эффективных терапевтических средств на основе тканевой инженерии и регенеративной медицины.
В этом контексте модель подлопаточной мышцы кролика (SSC) подходит из-за (i) ее анатомического сходства с костно-сухожильно-мышечной единицей человека (SSP), которая является наиболее часто повреждаемым участком RC; (ii) его патофизиологическое сходство с человеком с точки зрения фиброза и мышечно-жировой дистрофии (ФД); и (iii) его пригодность к хирургическим процедурам. Таким образом, целью данного исследования является описание хирургических техник индуцирования повреждения ССК RC. Вкратце, процедура включает в себя изоляцию SSC путем идентификации коракобрахиальной мышцы с последующим рассечением по всей толщине в месте соединения мышцы и сухожилия и обертыванием свободного конца мышечно-сухожильного соединения трубкой Пенроуза на силиконовой основе для предотвращения спонтанного повторного прикрепления. Гистологические оценки проводятся для мониторинга прогрессирования мышечной ФД через 4 недели после операции с использованием гематоксилина и эозина (H&E), а также трихромного окрашивания по Массону.
Потеря мышечной массы и ФД были очевидны через 4 недели после рассечения мышечно-сухожильного соединения SSC, как и при патофизиологических состояниях РК человека. Этот протокол демонстрирует шаги для успешного создания хронической модели травмы РК у кроликов, которая может служить мощным инструментом для изучения изменений скелетных мышц, связанных с патофизиологией РК, и помочь в разработке новых терапевтических стратегий при хроноподобных разрывах РК.
Хронические разрывы вращательной манжеты плеча характеризуются дегенеративными изменениями в мускулатуре и сухожилиях, включая атрофию мышц, накопление жировой ткани и фиброз, которые могут поставить под угрозу исход восстановления РК и, в конечном итоге, вызвать боль и дисфункцию плеча 1,2,3,4,5 . Чтобы лучше понять патогенез RC-разрыва и улучшить результаты хирургического вмешательства, крайне важно разработать соответствующие модели животных, которые могут имитировать аспекты анатомии и патофизиологии RC человека. В частности, модели RC-травм должны соответствовать следующим критериям: (i) отсутствие спонтанного заживления после травмы; (ii) содержат значительное присутствие фиброза, мышечной атрофии и накопления жировой ткани; и (iii) иметь достаточный размер, позволяющий приблизиться к хирургическим методам, используемым у людей6.
В этом контексте подлопаточная мышца кролика (SSC) может быть использована в качестве точной и надежной животной модели для изучения патофизиологии RC, учитывая ее уникальную анатомию, патофизиологический ответ и биомеханические свойства7. Действительно, анатомия SSC RC кролика похожа на человеческую надостную мышцу (SSP) RC, которая является мышечно-сухожильной единицей, наиболее часто связанной с травмами, возникающими в результате чрезмерной нагрузки 8,9. В частности, сухожильный комплекс SSC кролика проходит через костный туннель и под коракобрахиальной мышцей, что аналогично ситуации у человека, когда сухожильный комплекс SSP проходит через субакромиальный костный туннель и под коракоакромиальной связкой7. Это анатомическое сходство приводит к тому, что у кролика ССК происходят те же движения опорно-двигательного аппарата, что и у человека, при котором сухожилие проходит под акромионом во время подъема и отведения плечевой кости 7,10.
Кроме того, патогистологические изменения, сходные с человеческими RCtears 11, наблюдались у кроликов после разрыва SSC. В частности, мышечный живот подвергается тяжелой ФД со значительной потерей мышечной массы, уменьшением площади поперечного сечения мышечных волокон и повышенным ожирением. Кроме того, Otarodifard et al. оценили биомеханические характеристики ССК кроликов после (1) однорядной, (2) двухрядной и (3) чрескостно-эквивалентной РК-репарации и обнаружили, что первоначальные биомеханические характеристики этих репараций были аналогичны РК-репарациям ТКП человека, выполненной на трупных образцах12. Таким образом, анатомическое, физиологическое и биомеханическое сходство КСК кролика с человеческим ТКП делает его полезным для моделирования травм РК.
Несмотря на то, что многие виды животных, включая крыс, мышей, собак и овец, были использованы для изучения РЦ-заболевания и восстановления 6,13,14,15, степень хронизации травмы является ключевым фактором. Это связано с тем, что разрывы RC могут протекать бессимптомно и часто могут быть диагностированы гораздо позже, когда разрыв увеличился и стал хроническим по своей природе, при этом как сухожилие, так и мышца демонстрируют тяжелую дегенерацию16,17,18. Тем не менее, в большинстве моделей восстановления RC используются модели острой травмы, при которых здоровое сухожилие пересекается, а затем немедленно восстанавливается 19,20,21,22. Это происходит в основном из соображений логистической целесообразности и технической простоты, что приводит к небольшому количеству исследований, которые изучают патофизиологию РК в хронических условиях. Более того, некоторые животные модели могут обладать свойствами, которые препятствуют их использованию в исследованиях хронического РК.
Например, несмотря на то, что крыса широко использовалась для моделирования разрыва РЦ и вмешательства, отсутствие значительного накопления жира после травмы контрастирует с состоянием человека, а ее небольшой размерзатрудняет повторные хирургические процедуры. Кроме того, несмотря на то, что Gerber et al. использовали подостную мышцу овец для изучения мышечной атрофии и ФД после хронического разрыва RC24, существует некоторое анатомическое сходство между подостной мышцей овец и человеческим SSP, а также многочисленные логистические проблемы для изучения и размещения такой крупной модели животного. Кроме того, Gerber et al. разработали модель отсроченной RC-травмы у овец, освободив поверхностную головку подостной мышцы и сухожилия, чтобы имитировать особенности хронического RC-разрыва, а затем оценили эффективность различных методов восстановления сухожилия через 4-6 недель. К сожалению, эта хроническая модель овцы обладала ограничением, заключающимся в том, что конец высвобожденного сухожилия стал неотличим от рубцовой ткани во время второй хирургическойпроцедуры.
Coleman et al. также разработали модель хронического разрыва RC у овец, покрыв пересеченный конец сухожилия синтетической мембраной во время первоначальной операции, что позволило диффузировать питательные вещества и эффективно свести к минимуму образование рубцовой ткани вокруг поврежденной ткани, одновременно улучшая различение между сухожилием и рубцовой тканью26. Между тем, Turner et al. предположили, что отсроченное восстановление должно быть проведено в течение 4 недель, поскольку прямое повторное прикрепление редко происходит при массивнойретракции сухожилия. В совокупности эти исследования способствовали созданию воспроизводимых и надежных протоколов для успешного создания хронической модели травмы ССК у кроликов.
В этом протоколе установлена хроническая модель RC-травмы кроликов на 4-й неделе, при которой патологические изменения, связанные с фиброзом и FD-опосредованной атрофией мышц, могут быть изучены с помощью гистологических оценок. В частности, обертывание свободного конца мышечно-сухожильного соединения с помощью трубки Пенроуза на силиконовой основе во время первичной операции позволяет четко идентифицировать ткани РК во время второй хирургической процедуры и, следовательно, способствует безопасному восстановлению для изучения заживления РК с аугментацией каркаса и без нее. В целом, хроническая модель SSC кролика может лучше имитировать патофизиологию РК и предъявлять минимальные технические и логистические требования.
Воспроизводимая и физиологически релевантная животная модель дает возможность углубить понимание патогенеза заболевания, оценить результаты клинической терапии, а также усовершенствовать и развить хирургические методы лечения35. В этом исследовании была создана надежная и точная модель SSC кролика, которая имитирует аспекты анатомии и патофизиологии RC человека. Разрывы RC связаны с прогрессирующими и, вероятно, необратимыми мышечно-дегенеративными изменениями, приводящими к снижению потенциала заживления. Например, Ko et al. показали, что повторное прикрепление ТКП кролика через 6 недель не обратило вспять мышечную атрофию или ФД в последующие 6 недель. Такая FD-опосредованная мышечная атрофия влияет на несколько важных клинических параметров, включая силу сухожилий и диапазон движений суставов, что может повлиять на исходы хирургического вмешательства36,37.
Протокол, установленный здесь, показал значимые хронические признаки после рассечения мышечно-сухожильных единиц SSC. В частности, эти изменения включают заметное уменьшение мышечной массы и увеличение содержания жира и фиброзной ткани (Рисунок 2, Рисунок 3 и Рисунок 4). Эти результаты согласуются с дегенеративными изменениями, зарегистрированными при разрывах РЦ у человека38. В последние годы крыса стала одной из наиболее интенсивно изучаемых животных моделей РЦ и травм из-за ее высокого анатомического сходства как с человеческими, так и с крысиными SSP, путешествующими под акромионом38,39,40. Тем не менее, следует отметить, что часть ТКП крысы, которая проходит под акромиальной дугой, является мышечной, а не сухожильной, как у человека41. Самое главное, что Barton et al. обнаружили отсутствие значительного накопления жира после отслоения сухожилий SSP у крыс23, что контрастирует с состоянием человека42. Таким образом, считается, что комплекс SSC кролика может обеспечить подходящую модель для имитации хронического разрыва RC у людей.
Чтобы обеспечить воспроизводимость этой модели, при выполнении данного протокола стоит отметить два момента. Во-первых, после пересечения мышечно-сухожильных единиц свободный конец пересеченного сухожилия может подвергаться риску образования спаек, что может затруднить извлечение сухожилия для последующих манипуляций. Чтобы избежать этой проблемы, была использована нерассасывающаяся силиконовая трубка для обмотки свободного конца соединения мышцы и сухожилия после рассечения, чтобы избежать спонтанного прилипания к окружающим тканям, а также спонтанного заживления (рис. 1E). Кроме того, во время второй процедуры вмешательства (т.е. для выполнения надежной репарации; данные не показаны) можно четко идентифицировать путем обертывания конца поврежденных тканей во время первоначальной операции. Эта методика экономична, эффективна и может быть легко применена в хирургии43. Во-вторых, кролики являются очень чувствительным видом, который может демонстрировать пагубное поведение после операции. Чтобы избежать таких проблем, настоятельно рекомендуется также использовать мягкий ошейник, чтобы предотвратить нежелательное поведение, включая членовредительство, облизывание хирургических участков и снятие швов (рисунок 1I). По сравнению с коммерчески обычными электронными ошейниками, изготовленными из жесткого пластика, самодельный мягкий ошейник не вызывал никаких повреждений кожи или других побочных эффектов, которые влияли бы на благополучие животных или качество научных исследований. В совокупности такие шаги имеют решающее значение для создания точно воспроизводимой модели RC-травмы кролика и дают возможность для изучения стратегий регенеративной репарации.
Для изучения патофизиологии и заживления сухожилий на животной модели необходимо создать отчетливую и воспроизводимую травму, а также тщательно выбрать точки времени исследования. Подавляющее большинство исследований повреждений и заживления сухожилий было выполнено на полностью пересеченных сухожилиях животных44, поскольку рассечение является простой процедурой, которая обладает высокой воспроизводимостью и может адекватно имитировать клинический сценарий45,46. Huegel et al. показали, что повреждение частично пересеченного сухожилия было менее серьезным, чем повреждение полностью пересеченного сухожилия, а иммобилизация оказывала пагубное влияние на механику сухожилия, включая увеличениежесткости сустава. Для оценки атрофии и ФД, которые наблюдаются при массивном разрыве RC, необходимо определить экспериментально наблюдаемые характерные моменты времени. Гупта и др. валидировали модель RC-травмы у самцов кроликов и наблюдали мышечную атрофию через 2 и 6 недель, с повышенным содержанием жира в более поздние моменты времени (менее 5% содержания жира через 2 недели по сравнению с более чем 10% содержанием жира через 6 недель), что согласуется с патологическим процессом, наблюдаемым приразрывах RC у человека. В этом исследовании массивный разрыв RC был создан путем рассечения мышечно-сухожильной единицы SSC у самцов и самок кроликов в течение 4 недель, что привело к SSC muscle FD (содержание жира 36,5%). Таким образом, 4-недельная временная точка подходит для генерации SSC мышечного FD у самцов и самок новозеландских белых кроликов.
У этого исследования есть несколько ограничений. К ним относятся: (i) этапы, связанные с созданием модели на животных, такие как относительно короткий период времени и потенциально воспалительные материалы (трубки Пенроуза на основе силикона) для получения хронической травмы; (ii) характеристика и анализ моделей животных, например, отсутствие анализа походки и электромиографии для оценки кинематики суставов и создания сократительной силы мышц; и (iii) сравнение моделей животных, например, отсутствие сравнения с другими местами RC-травм.
С точки зрения генерации модели, травмы РК у человека обычно включают прогрессирующую атрофию и ФД, которые могут возникать в течение нескольких лет, что относительно дольше, чем 4-недельный временной отметка, описанный здесь. Это считается приемлемым, так как животная модель, которая генерирует около 36,5% внутримышечного жира за относительно короткий промежуток времени, будет удобной с точки зрения логистики и может быть продлена при необходимости. Кроме того, биосовместимость имплантатов на основе силикона, таких как трубки Пенроуза, была источником давних споров из-за сообщений о клеточном иммунном ответе и воспалении47; таким образом, альтернативный инертный материал, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ), может быть заменен для обмотки резецированного сухожилия при проведении исследований RC, связанных с воспалением.
С точки зрения характеристики и анализа животных моделей, отсутствие анализа походки49 и электромиографических исследований50 может ограничить результаты исследования качественными гистологическими данными. Эти аспекты могут быть рассмотрены в будущих исследованиях с использованием видеоанализа движения51 и поверхностной электромиографии50 для получения количественных данных о кинематике плечевого сустава и работе RC-мышц.
С точки зрения сравнения моделей, поскольку сухожилия SSP и подостной мышцы у кроликов также широко использовались для исследований RC, сравнение тяжести травмы, включая FD среди этих различных участков травмы, в будущем позволит выявить дополнительные участки для оптимизации модели.
Таким образом, в этом исследовании был разработан протокол моделирования хроноподобных травм РЦ у самцов и самок кроликов. Данная модель удобна для исследователей своей простотой (транссекция) и относительно коротким периодом индуцирования хроники (4 недели) при формировании большой степени (36,5%) внутримышечной ФД. Таким образом, ожидается, что этот протокол поможет исследователям в изучении патофизиологии РК, а также будет способствовать разработке новых терапевтических средств для восстановления и регенерации мышц и сухожилий.
The authors have nothing to disclose.
Исследование Дай Фэй Элмер Кер финансируется Бюро по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов Гонконга (Фонд здравоохранения, медицины и исследований: 08190466), Комиссии по инновациям и технологиям, САР Гонконг (Tier 3 Award: ITS/090/18; Health@InnoHK программы), Совет по исследовательским грантам Гонконга, САР Гонконг (Early Career Scheme Award: 24201720 и General Research Fund: 14213922) и Китайский университет Гонконга (Faculty Innovation Award: FIA2018/A/01). Исследование Дэна Вана финансируется Бюро по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов Гонконга (Health Medical and Research Fund, 07180686), Комиссии по инновациям и технологиям САР Гонконг (Tier 3 Award: ITS/333/18; Health@InnoHK программы) и Совет по исследовательским грантам Гонконга, САР Гонконг (Общий исследовательский фонд: 14118620 и 14121121).
Surgical tools | |||
4-0 Poly glycolic acid (PGA) | e-Sutures | GBK884 | |
Forceps with teeth | Taobao, China | ||
Fine scissors | Taobao, China | ||
Hemostatic forceps | Taobao, China | ||
Needle holders | Taobao, China | ||
Surgical scalpel with handle | Taobao, China | 11 | |
Suture (4-0 Silk) | Taobao, China | 19054 | |
Surgical accessories | |||
Cotton balls | Taobao, China | ||
Gauze | Taobao, China | ||
Razor | Taobao, China | ||
Surgical heating pad | Taobao, China | ||
Surgical lamp | |||
Syringe with needles | Taobao, China | 1 mL, 5 mL, 10 mL | |
Drugs | |||
Buprenorphine | LASEC, CUHK | 0.12 mg/kg | |
Bupivacaine | Tin Hang Tech | b5274-5g | 1-2 mg/kg |
Cephalexin | Santa Cruz Biotechnology (Genetimes) | sc-487556 | 20 mg/kg |
Ketamine | LASEC, CUHK | 35 mg/kg | |
Sodium pentobarbital | LASEC, CUHK | more than 60 mg/kg | |
Xylazine | LASEC, CUHK | 5 mg/kg | |
Equipment | |||
Nikon Ni-U Eclipse Upright Microscope | Nikon Instruments Inc, USA | ||
Software | |||
Adobe Photoshop 20.01 | Adobe Inc, USA | ||
Other reagents | |||
Betadine | Taobao, China | 5% | |
Ethanol | Taobao, China | 70% | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | 10% |
Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15713 | 4% |
Silicone tubing | Easy Thru, China | ISO13485 | |
Saline | Taobao, China | ||
Histological staining reagents | |||
Eosin Stain Solution | Sigma-Aldrich | R03040 | 5% Aqueous |
Hematoxylin Solution | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
Trichrome Stain (Masson) Kit | Sigma-Aldrich | HT15 |