Summary

In Vitro Hyaluronan Bakımından Zengin Hücre Dışı Matriksin Nöral Kret Hücre Migrasyonu Üzerine Etkilerinin İncelenmesi

Published: February 10, 2023
doi:

Summary

Bu protokol, nöral krest hücrelerinin hyaluronan bakımından zengin hücre dışı matrise in vivo göçünde rol oynayan moleküllerin fonksiyonel analizi için uygun bir in vitro migrasyon deneyini özetlemektedir.

Abstract

Nöral krest hücreleri (NCC’ler), nöral tüpün dorsal bölgesinden kaynaklanan yüksek oranda göçmen hücrelerdir. NCC’lerin nöral tüpten göçü, NCC üretimi ve ardından hedef bölgelere doğru göçleri için önemli bir süreçtir. Çevreleyen nöral tüp dokuları da dahil olmak üzere NCC’lerin göç yolu, hyaluronan (HA) bakımından zengin hücre dışı matriksi içerir. Bu çalışmada, nöral tüpten HA bakımından zengin bu çevre dokulara NCC migrasyonunu modellemek için, HA (ortalama moleküler ağırlık: 1.200-1.400 kDa) ve kollajen tip I’den (Col1) oluşan karışık bir substrat migrasyon testi yapılmıştır. Bu migrasyon testi, NCC hücre hattının, O9-1 hücrelerinin, karışık substrat üzerinde yüksek oranda göçmen olduğunu ve HA kaplamasının göç sırasında fokal adezyonlar bölgesinde bozulduğunu göstermektedir. Bu in vitro model, NCC göçünde yer alan mekanik temelin daha fazla araştırılması için yararlı olabilir. Bu protokol, NCC göçünü incelemek için farklı substratları iskele olarak değerlendirmek için de geçerlidir.

Introduction

Nöral krest hücreleri (NCC’ler), gelişmekte olan embriyolarda bulunan multipotent bir hücre popülasyonudur ve nörülasyon sırasında nöral plak sınırından köken alırlar. Periferik sinir sistemi, kardiyovasküler sistem, kraniyofasiyal dokular ve iskelet1 dahil olmak üzere çeşitli dokuların oluşumuna katkıda bulunurlar. Nöral plak sınırında indüksiyon ve NCC spesifikasyonundan sonra, NCC’ler nöroepitelden göç eder ve NCC kaynaklı doku bölgelerine doğru göç eder1.

Hyaluronan (HA), hücre dışı matriksin (ECM) bir bileşeni olarak çeşitli dokulara dağılmış sülfatlanmamış bir glikozaminoglikandır. HA’nın embriyo gelişimindeki önemi, hyaluronan metabolizmasından sorumlu genlerin ablasyonu yoluyla model sistemlerde gösterilmiştir. Örneğin, Xenopus’taki hyaluronan sentaz genlerindeki (Has1 ve Has2) mutasyonların NCC migrasyon kusurlarına ve kraniyofasiyal malformasyon2’ye yol açtığı bulunmuştur. Ek olarak, HA bağlayıcı proteoglikanlar, agrekan ve versikanın, NCC migrasyonu3 üzerinde inhibitör etkiler gösterdiği bildirilmiştir. Farelerde, Has2 ablasyonu endokardiyal yastık oluşumunda ciddi kusurlara yol açarak gebeliğin ortasında (E9.5-10) öldürücülük 4,5,6 ile sonuçlanır.

Bir hücre yüzeyi hyaluronidaz olan transmembran protein 2’nin (Tmem2), yakın zamanda, yapışma bölgelerinde matriksle ilişkili HA’yı çıkararak integrin aracılı kanser hücresi yapışmasını ve göçünü teşvik etmede kritik bir rol oynadığı gösterilmiştir 7,8. Daha yakın zamanlarda, Inubushi ve ark.9, Tmem2’deki bir eksikliğin, NCC göçü / göçü ve sağkalımındaki anormallikler nedeniyle ciddi kraniyofasiyal defektlere yol açtığını göstermiştir. Önceki çalışmada9, NCC oluşumu ve migrasyonu sırasında Tmem2 ekspresyonu analiz edilmiştir. Tmem2 ekspresyonu, NCC delaminasyon bölgesinde ve Sox9-pozitif NCC’lerin göç etmesinde gözlendi (Şekil 1). Ek olarak, Tmem2-tükenmiş fare O9-1 nöral krest hücrelerini kullanarak, çalışma, Tmem2’nin in vitro ekspresyonunun, O9-1 hücrelerinin fokal adezyonlar oluşturması ve HA içeren substratlara göçleri için gerekli olduğunu göstermiştir (Şekil 2 ve Şekil 3)9.

Bu sonuçlar, Tmem2’nin NCC yapışması ve HA bakımından zengin ECM yoluyla migrasyon için de önemli olduğunu güçlü bir şekilde göstermektedir. Bununla birlikte, HA bakımından zengin ECM içindeki NCC yapışması ve göçünün moleküler mekanizması hala belirsizdir. Bu nedenle, HA bakımından zengin ECM içinde NCC yapışmasını ve göçünü tam olarak araştırmak için bir in vitro kültür deneysel sistemi kurmak gereklidir.

Hücre göçünü test etmede kullanılan sayısız yaklaşımdan, hücre yarası kapatma temelli tahlil, fizyoloji ve onkoloji alanlarında sıklıkla kullanılan basit bir yöntemdir10. Bu yaklaşım, in vivo fenotiple ilgisi nedeniyle yararlıdır ve hücre göçü sırasında ilaçların ve kemoattractanların rollerinin belirlenmesinde etkilidir11. Hem tüm hücre kütlelerinin hem de tek tek hücrelerin migrasyon kabiliyetini, zaman içindeki hücre boşluk mesafelerini ölçerek değerlendirmek mümkündür11. Bu makalede, nöral tüpü çevreleyen HA bakımından zengin dokulara NCC migrasyonunu modellemek için modifiye edilmiş in vitro yara kapatma temelli bir tahlil tanıtılmıştır. Bu prosedür, ECM iskelesinin NCC göçündeki rolünü analiz etmek için farklı ECM bileşenlerini (yani, kollajenler, fibronektin ve laminin) incelemek için de geçerlidir.

Protocol

Tüm prosedürler Osaka Üniversitesi Diş Hekimliği Enstitüsü Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. 1. Fare kranial nöral krest hücrelerinin kültürü NOT: Bu çalışmada kullanılan nöral krest hücre hattı, başlangıçta Wnt1-Cre’den türetilen O9-1 hücrelerini içerir; E8.5 fare embriyolarından izole edilen R26R-GFP eksprese eden hücreler12 (tartışmaya bakınız). O9-1 hücrelerin…

Representative Results

Burada açıklanan protokol kullanılarak Col1 ve yüksek moleküler ağırlıklı HA’dan (ortalama moleküler ağırlık: 1.200-1.400 kDa) oluşan karışık substratlar üzerinde bir migrasyon testi yapıldı. Boşluğun sınırındaki O9-1 hücrelerinin HA bakımından zengin boşluğa kolayca göç ettiği bulunmuştur (Şekil 4). Bir FA belirteci olan vinkülin14 için immün boyama, O9-1 hücrelerinin HA yıkımı bölgelerinde fokal adezyonlar (FA’lar) oluştur…

Discussion

Çeşitli ECM bileşenleri NCC göçünü/göçünü düzenler. Örneğin, HA, NCC göçünü 2,15 pozitif olarak düzenler. İlginç bir şekilde, bir hücre yüzeyi hyaluronidaz olan Tmem2’nin genetik fare modellerine dayanan bir çalışma, NCC migrasyonunda HA bozunmasının gerekliliğini aydınlatmıştır9. Kollajenler ayrıca nöral tüp16’yı çevreleyen ECM’de de bol miktarda bulunur. Küçük bir lösin b…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Fumitoshi Irie ve Yu Yamaguchi’ye bu yöntemin oluşturulmasındaki teşvikleri ve nazik önerileri için büyük teşekkürlerimi sunuyorum. Bu çalışma, Japonya Bilimi Geliştirme Derneği’nden (#19KK0232 T.I.’a, #20H03896 T.I.’a) bilimsel araştırma programları için hibe yardımı ile desteklenmiştir. HA’nın cam substratlar üzerine kaplanması ve substratlar üzerindeki in situ HA bozunma tahlilleri için orijinal yöntem Yamamoto et al. (2017) 8’de tarif edilirken, HA / Col1 karışık substratlarının hazırlanması için yöntem Irie et al. (2021) 7’de açıklanmıştır.

Materials

10cm cell culture dish CORNING Cat. 353003
1X PBS Millipore Cat. No. BSS-1005-B
2-well culture inserts ibidi Cat. No. 80209
Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG Invitrogen Cat. A21422 Goat derived anti-mouse secondary antibody
automated cell counter Bio-Rad Cat. No. TC20
CELLBANKER ZENOGEN PHARMA Cat. 11910 Cell freezing medium
collagen type I Sigma Cat. No. 08-115
Complete ES Cell Medium Millipore Cat. No. ES-101-B
DAPI Invitrogen Cat. 10184322
Dulbecco’s Modified Eagle Medium  Gibco Cat. 11971025
Fetal Bovine serum Gibco Cat. 10270106
fluorescence microscope Keyence Cat. No. BZ-X700
Fluoresent labelled HA PG Research FAHA-H2
Glas bottom dish Iwaki Cat. 11-0602
glutaldehyde Sigma Cat. No. G5882
Matrigel Fisher Cat. No. CB-40234 The basement-membrane matrix
monoclonal anti-vinculin antibody Sigma Cat. No. V9264
mounting media Dako S3023
Normal goat serum Fisher Cat. 50062Z
O9-1 cells Millipore Cat. No. SCC049
Paraformaldehyde Sigma Cat. 158127
triethoxysilane Sigma Cat. No. 390143
trypsin-EDTA Millipore Cat. No. SM-2003-C

References

  1. Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
  2. Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
  3. Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
  4. Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
  5. Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
  6. Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
  7. Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
  8. Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
  9. Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
  10. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
  11. Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
  12. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  13. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
  14. Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
  15. Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
  16. Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
  17. Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
  18. Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. 발생학. 136 (1), 222-238 (1989).
  19. Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
  20. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  21. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
  22. Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
  23. Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
  24. Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
  25. Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).

Play Video

Cite This Article
Inubushi, T. In Vitro Investigation of the Effects of the Hyaluronan-Rich Extracellular Matrix on Neural Crest Cell Migration. J. Vis. Exp. (192), e64749, doi:10.3791/64749 (2023).

View Video