Микродиссекция и сканирующая электронная микроскопия всего массива Визуализация сосудистого сплетения мыши

Жесткие барьеры отделяют центральную нервную систему (ЦНС) от периферии, включая гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и гемато-спинномозговой жидкость (СМЖ). Эти барьеры защищают ЦНС от внешних воздействий и обеспечивают сбалансированную и контролируемую микросреду ^1,2,3. В то время как ГЭБ широко изучался с течением времени, гемато-ликворный барьер, расположенный в сосудистом сплетении (ХП), только приобрел растущий исследовательский интерес в течение последнего десятилетия. Этот последний барьер может быть обнаружен в четырех желудочках головного мозга (рис. 1A, B) и характеризуется одним слоем эпителиальных клеток сосудистого сплетения (CPE), окружающих центральную строму, негерметичные капилляры, фибробласты и популяцию лимфоидных и миелоидных клеток (рис. 1C)4,5,6 . Клетки CPE прочно соединены между собой плотными соединениями, что предотвращает утечку из нижележащих фенестрированных кровеносных капилляров в спинномозговую жидкость и мозг. Кроме того, транспорт через клетки CPE регулируется рядом транспортных систем внутрь и наружу, которые управляют притоком полезных соединений (например, питательных веществ и гормонов) из крови в спинномозговую жидкость и оттоком вредных молекул (например, метаболических отходов, избытка нейротрансмиттеров) в другом направлении ^1,6. Чтобы иметь возможность выполнять свою активную транспортную функцию, клетки CPE содержат многочисленные митохондрии в своей цитоплазме⁷. Кроме того, CP является основным источником спинномозговой жидкости и действует как привратник мозга благодаря присутствию резидентных воспалительных клеток¹. Благодаря своему уникальному расположению между кровью и мозгом, CP также идеально подходит для осуществления иммунного надзора⁸.

Рисунок 1: Схематический обзор расположения и состава сосудистого сплетения (ХП). (A, B) Ткань CP находится в двух боковых, третьем и четвертом желудочках (A) человеческого и (B) мышиного мозга. (C) Ткань CP состоит из одного слоя плотно соединенных кубовидных клеток эпителия CP (CPE), окружающих фенестрированные капилляры, рыхлую соединительную ткань, лимфоидные и миелоидные клетки, и образует гемато-спинномозговой барьер (адаптированный и модифицированный из ссылки²³). Рисунок создан с помощью Biorender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

За последнее десятилетие все больше доказательств, в том числе несколько отчетов нашей исследовательской группы, показали, что ДЦП играет центральную роль в здоровье и болезнях 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Например, известно, что стареющий барьер кровь-спинномозговая жидкость проявляет морфологические изменения, в частности, в ядрах, микроворсинках и базальной мембране ^1,19. Кроме того, в контексте болезни Альцгеймера нарушается общая целостность барьера, и все эти возрастные изменения кажутся еще более выраженными ^1,8,20. В дополнение к морфологическим изменениям, транскриптом, протеом и секретом CP изменяются во время болезни ^12,21,22,23. Таким образом, передовые знания о ДЦП необходимы для лучшего понимания его роли в неврологических заболеваниях и потенциальной разработки новых терапевтических стратегий.

Эффективный метод точной микродиссекции ЦП из желудочков головного мозга является первым бесценным шагом, позволяющим правильно исследовать эту крошечную структуру мозга. Из-за своей высокой васкуляризированной природы (рис. 2B) CP, плавающий внутри желудочковых полостей мозга, может быть идентифицирован с помощью бинокулярного микроскопа. Тем не менее, транскардиальная перфузия часто требуется для последующего анализа, что усложняет правильную идентификацию и изоляцию ткани CP (рис. 2C). Если позволяют дальнейшие этапы обработки (например, в случае анализа РНК и белка), CP можно визуализировать с помощью транскардиальной перфузии бромфенольным синим (рис. 2A). В нескольких публикациях уже описывается выделение ДЦП из мозга^{крысы 24} и мышного детеныша 25. Здесь описан метод изоляции микродиссекции для выделения CP от взрослых мышей. Важно отметить, что этот метод изоляции сохраняет жизнеспособность, функцию и структуру клеток внутри CP. Здесь описана изоляция ЦП, плавающая в четвертом и боковых желудочках. Короче говоря, мышей неизлечимо анестезируют и, при необходимости, транскардиально перфузируют. Однако следует отметить, что перфузия может повредить структуру клеток внутри КП. Следовательно, если образец должен быть проанализирован с использованием просвечивающей электронной микроскопии (TEM), сканирующей электронной микроскопии с последовательным блоком (SBF-SEM) или сфокусированного ионного пучка SEM (FIB-SEM), перфузию не следует проводить. Затем весь мозг изолируется, и щипцы используются для сагиттальной гемисекции мозга. Отсюда ХП, плавающие в боковых желудочках, могут быть идентифицированы и рассечены, в то время как ХП из четвертого желудочка может быть выделен из мозжечковой стороны мозга.

Рисунок 2: Визуализация (A-C) четвертого и (D-F) бокового сосудистого сплетения желудочка (CP) после (A, D) перфузии бромфенольного синего, (B, E) отсутствия перфузии и (C, F) перфузии PBS / гепарином. Снимки сделаны с помощью стереомикроскопа (8-32-кратное увеличение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

После того, как CP правильно рассечен из желудочков мозга, можно применить целый репертуар методов, чтобы получить дальнейшее понимание функции этой структуры. Например, проточная цитометрия или секвенирование одноклеточной РНК могут быть выполнены для количественного определения и фенотипического анализа инфильтрирующих воспалительных клеток при определенных условиях^{заболевания 26,27}. В дополнение к клеточному составу, молекулярный состав CP может быть проанализирован для оценки присутствия цитокинов и хемокинов с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), иммуноблоттинга или одновременного анализа нескольких цитокинов с использованием массива^{цитокиновых шариков 28}. Кроме того, транскриптомный, сосудистый, иммунно-клеточный гистологический и секретомный анализы могут быть выполнены на микрорассеченных эксплантатах^{CP 29}. Здесь сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) на всей монтировке CP используется для получения общего представления о структуре CP. SEM использует пучок сфокусированных электронов для сканирования поверхности и создания изображения топографии и состава поверхности. Поскольку длина волны электронов намного меньше, чем у света, разрешение СЭМ находится в нанометровом диапазоне и превосходит разрешение светового микроскопа. Следовательно, морфологические исследования на субклеточном уровне могут быть выполнены с помощью SEM. Вкратце, рассеченный CP немедленно переносится в фиксатор, содержащий глутаровый альдегид, для фиксации в течение ночи с последующей осмикацией и окрашиванием уранилацетатом. Затем образцы обрабатывают окраской аспартата свинца, обезвоживают и, в конечном итоге, внедряют для визуализации.

Таким образом, этот протокол способствует эффективному выделению CP из желудочков головного мозга мыши, которые могут быть дополнительно проанализированы с использованием различных последующих методов для исследования его структуры и функции.