Denna studie visar leverans av en repetitiv traumatisk hjärnskada till möss och samtidig implantation av ett kranialfönster för efterföljande intravital avbildning av en neuron-uttryckt EGFP med hjälp av tvåfotonmikroskopi.
Målet med detta protokoll är att visa hur man longitudinellt visualiserar uttrycket och lokaliseringen av ett protein av intresse inom specifika celltyper i ett djurs hjärna, vid exponering för exogena stimuli. Här visas administrering av en traumatisk hjärnskada (TBI) och samtidig implantation av ett kranialfönster för efterföljande longitudinell intravital avbildning i möss. Möss injiceras intrakraniellt med ett adenoassocierat virus (AAV) som uttrycker förstärkt grönt fluorescerande protein (EGFP) under en neuronal specifik promotor. Efter 2 till 4 veckor utsätts mössen för en upprepad TBI med hjälp av en viktminskningsanordning över AAV-injektionsstället. Under samma kirurgiska session implanteras mössen med en huvudstolpe av metall och sedan ett kranialfönster av glas över det plats där TBI slår in. Uttrycket och den cellulära lokaliseringen av EGFP undersöks med hjälp av ett tvåfotonmikroskop i samma hjärnregion som utsatts för trauma under loppet av månader.
Traumatisk hjärnskada (TBI), som kan uppstå till följd av idrottsskador, fordonskollisioner och militära strider, är ett globalt hälsoproblem. TBI kan leda till fysiologiska, kognitiva och beteendemässiga brister och livslång funktionsnedsättning eller dödlighet 1,2. TBI:s svårighetsgrad kan klassificeras som mild, måttlig och svår, de allra flesta är mild TBI (75–90 %)3. Det blir alltmer erkänt att TBI, särskilt upprepade förekomster av TBI, kan främja neuronal degeneration och fungera som riskfaktorer för flera neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Alzheimers sjukdom (AD), amyotrofisk lateralskleros (ALS), frontotemporal demens (FTD) och kronisk traumatisk encefalopati (CTE)4,5,6. De molekylära mekanismerna bakom TBI-inducerad neurodegeneration är dock fortfarande oklara, och utgör därför ett aktivt studieområde. För att få insikt i hur nervceller svarar på och återhämtar sig från TBI beskrivs här en metod för att övervaka fluorescerande märkta proteiner av intresse, särskilt inom nervceller, genom longitudinell intravital avbildning hos möss efter TBI.
För detta ändamål visar denna studie hur man kan kombinera ett kirurgiskt ingrepp för administrering av TBI med sluten skalle som liknar det som har rapporterats tidigare7,8, tillsammans med ett kirurgiskt ingrepp för implantation av ett kranialfönster för intravital avbildning nedströms, som beskrivs av Goldey et al9. Det är inte möjligt att implantera ett kranialfönster först och därefter utföra en TBI i samma region, eftersom effekten av viktnedgången som inducerar TBI sannolikt kommer att skada fönstret och orsaka irreparabel skada på musen. Därför utformades detta protokoll för att administrera TBI och sedan implantera kranialfönstret direkt över nedslagsstället, allt inom samma kirurgiska session. En fördel med att kombinera både TBI och kranialfönsterimplantation i en enda kirurgisk session är en minskning av antalet gånger en mus utsätts för operation. Dessutom gör det det möjligt att övervaka det omedelbara svaret (dvs. på tidsskalan av timmar) på TBI, i motsats till att implantera fönstret vid en senare kirurgisk session (dvs. initial avbildning som börjar på en tidsskala på dagar efter TBI). Det kraniala fönstret och den intravitala avbildningsplattformen erbjuder också fördelar jämfört med övervakning av neuronala proteiner med konventionella metoder som immunfärgning av fixerade vävnader. Till exempel krävs färre möss för intravital avbildning, eftersom samma mus kan studeras vid flera tidpunkter, i motsats till separata kohorter av möss som behövs för diskreta tidpunkter. Vidare kan samma neuroner övervakas över tid, vilket gör att man kan spåra specifika biologiska eller patologiska händelser inom samma cell.
Som ett proof of concept demonstreras det neuronspecifika uttrycket av förstärkt grönt fluorescerande protein (EGFP) under synapsinpromotorn här10. Detta tillvägagångssätt kan utvidgas till 1) olika typer av hjärnceller genom att använda andra celltypsspecifika promotorer, såsom myelinbasprotein (MBP) promotor för oligodendrocyter och gliafibrillärt surt protein (GFAP) promotor för astrocyter11, 2) olika målproteiner av intresse genom att smälta samman deras gener med EGFP-genen, och 3) samuttrycka flera proteiner sammansmälta till olika fluoroforer. Här förpackas EGFP och uttrycks via adenoassocierat virus (AAV) genom en intrakraniell injektion. En TBI med sluten skalle administreras med hjälp av en viktdroppsanordning, följt av implantation av ett kranialfönster. Visualisering av neuronal EGFP uppnås genom kranialfönstret, med hjälp av tvåfotonmikroskopi för att detektera EGFP-fluorescens in vivo. Med tvåfotonlasern är det möjligt att tränga djupare in i den kortikala vävnaden med minimal fotoskada, vilket möjliggör upprepad longitudinell avbildning av samma kortikala regioner inom en enskild mus i dagar och upp till månader12,13,14,15. Sammanfattningsvis syftar detta tillvägagångssätt att kombinera en TBI-operation med intravital avbildning till att öka förståelsen för de molekylära händelser som bidrar till TBI-inducerad sjukdomspatologi16,17.
I denna studie kombinerades AAV-injektion, TBI-administrering och en huvudstolpe med kraniell fönsterimplantation för longitudinell avbildningsanalys av EGFP-märkta neuroner i mushjärnbarken (lager IV och V) för att observera effekterna av TBI på kortikala neuroner. Denna studie noterar att den TBI-plats som valts här, ovanför hippocampus, ger en relativt plan och bred yta för implantation av kranialfönstret. Omvänt är skallen relativt smal framför detta ställe, och därför är det svårt att säkerställa…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr. Miguel Sena-Esteves vid University of Massachusetts Chan Medical School för att ha gett bort AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP-viruset, och Debra Cameron vid University of Massachusetts Chan Medical School för att ha ritat skissen med mössskallen. Vi tackar också nuvarande och tidigare medlemmar i Bosco-, Schafer- och Henninger-laboratorierna för deras förslag och stöd. Detta arbete finansierades av försvarsdepartementet (W81XWH202071/PRARP) till DAB, DS och NH.
Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
Saline | Bioworld | L19102411PR | |
Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |