使用双光子显微镜对闭合颅骨创伤性脑损伤和颅窗小鼠荧光蛋白表达进行活体成像

创伤性脑损伤 （TBI） 可由运动损伤、车辆碰撞和军事战斗引起，是一个全球性的健康问题。TBI 可导致生理、认知和行为缺陷，以及终身残疾或死亡 ^1,2。TBI 的严重程度可分为轻度、中度和重度，绝大多数为轻度 TBI （75%-90%）³。人们越来越认识到，TBI，特别是TBI的重复发生，可以促进神经元变性，并成为多种神经退行性疾病的危险因素，包括阿尔茨海默病（AD），肌萎缩侧索硬化症（ALS），额颞叶痴呆（FTD）和慢性创伤性脑病（CTE）^4,5,6.然而，TBI诱导的神经退行性变的分子机制仍不清楚，因此是一个活跃的研究领域。为了深入了解神经元如何对 TBI 做出反应并从中恢复，本文描述了一种在 TBI 后通过纵向活体成像在小鼠中监测荧光标记的目标蛋白的方法，特别是在神经元内。

为此，本研究展示了如何将用于闭合颅骨 TBI 的外科手术（类似于之前报道的^7,8）与植入颅内窗口的外科手术相结合^，用于下游活体成像，如 Goldey 等人所述⁹.值得注意的是，先植入颅窗，然后在同一区域进行TBI是不可行的，因为诱发TBI的体重下降的影响可能会损坏颅窗并对小鼠造成无法弥补的伤害。因此，该方案旨在在同一手术过程中进行 TBI，然后将颅窗直接植入撞击部位。在一次手术中结合 TBI 和颅窗植入的一个优点是减少了小鼠接受手术的次数。此外，它允许人们监测对 TBI 的即时反应（即，在小时的时间尺度上），而不是在以后的手术过程中植入窗口（即，在 TBI 后几天的时间尺度上开始初始成像）。与通过固定组织免疫染色等传统方法监测神经元蛋白相比，颅窗和活体成像平台也具有优势。例如，活体成像需要较少的小鼠，因为同一只小鼠可以在多个时间点进行研究，而不是在离散时间点需要单独的小鼠队列。此外，可以随着时间的推移监测相同的神经元，从而允许跟踪同一细胞内的特定生物学或病理事件。

作为概念证明，这里证明了突触蛋白启动子下增强的绿色荧光蛋白 （EGFP） 的神经元特异性表达¹⁰。这种方法可以扩展到 1） 通过利用其他细胞类型特异性启动子来扩展不同的脑细胞类型，例如少突胶质细胞的髓鞘碱性蛋白 （MBP） 启动子和星形胶质细胞的神经胶质纤维酸性蛋白 （GFAP） 启动子¹¹ ，2） 通过将其基因与 EGFP 基因融合不同的目标蛋白，以及 3） 共表达融合到不同荧光团的多种蛋白质。在这里，EGFP 通过颅内注射通过腺相关病毒 （AAV） 递送进行包装和表达。使用减重装置进行闭合性颅骨 TBI，然后植入颅窗。神经元EGFP的可视化是通过颅窗实现的，使用双光子显微镜检测体内的EGFP荧光。使用双光子激光，可以以最小的光损伤更深入地穿透皮质组织，从而可以对单个小鼠内的相同皮质区域进行数天至数月的重复纵向成像12,13,14,15。总之，这种将 TBI 手术与活体成像相结合的方法旨在促进对导致 TBI 诱发疾病病理学的分子事件的理解^16,17。