Summary

Анализ вытягивания в сочетании с коэкспрессией в клетках бактерий как эффективный по времени инструмент для тестирования сложных белково-белковых взаимодействий

Published: December 23, 2022
doi:

Summary

Здесь мы описываем метод бактериальной коэкспрессии дифференциально меченных белков с использованием набора совместимых векторов, за которым следуют традиционные методы вытягивания для изучения белковых комплексов, которые не могут собираться in vitro.

Abstract

Pulldown – это простой и широко используемый анализ белково-белкового взаимодействия. Однако у него есть ограничения в изучении белковых комплексов, которые не собираются эффективно in vitro. Такие комплексы могут потребовать котрансляционной сборки и присутствия молекулярных шаперонов; Либо они образуют стабильные олигомеры, которые не могут диссоциировать и повторно ассоциировать in vitro , либо нестабильны без связывающего партнера. Чтобы преодолеть эти проблемы, можно использовать метод, основанный на бактериальной коэкспрессии дифференциально меченных белков с использованием набора совместимых векторов, за которыми следуют обычные методы вытягивания. Рабочий процесс более эффективен по времени по сравнению с традиционным вытягиванием, поскольку в нем отсутствуют трудоемкие этапы отдельной очистки взаимодействующих белков и их последующей инкубации. Другим преимуществом является более высокая воспроизводимость из-за значительно меньшего количества стадий и более короткого периода времени, в течение которого белки, существующие в среде in vitro , подвергаются протеолизу и окислению. Метод был успешно применен для изучения ряда белок-белковых взаимодействий, когда другие методы in vitro оказались непригодными. Метод может быть использован для пакетного тестирования белок-белковых взаимодействий. Показаны репрезентативные результаты исследований взаимодействий между доменом BTB и внутренне неупорядоченными белками, а также гетеродимеров доменов, связанных с цинковым пальцем.

Introduction

Обычный вытягивание широко используется для изучения белково-белковых взаимодействий1. Однако очищенные белки часто не взаимодействуют эффективно in vitro2,3, а некоторые из них нерастворимы без своего партнера по связыванию 4,5. Такие белки могут потребовать котрансляционной сборки или присутствия молекулярных шаперонов 5,6,7,8,9. Другим ограничением обычного вытягивания является тестирование возможной гетеромультимеризационной активности между доменами, которые могут существовать в виде стабильных гомоолигомеров, собранных котрансляционно 8,10, поскольку многие из них не могут диссоциировать и повторно ассоциировать in vitro во время инкубации. Было обнаружено, что совместное выражение полезно для преодоления таких проблем 3,11. Коэкспрессия с использованием совместимых векторов в бактериях была успешно использована для очистки больших мультисубъединичных макромолекулярных комплексов, включая поликомбный репрессивный комплекс PRC212, РНК-полимеразу II медиаторный головной модуль13, базовую пластинубактериофага Т4 14, комплекс SAGA деубиквитинилазный модуль 15,16 и ферритин17. Источниками репликации, обычно используемыми для совместной экспрессии, являются ColE1, p15A18, CloDF1319 и RSF20. В коммерчески доступной системе экспрессии Duet эти источники сочетаются с различными генами устойчивости к антибиотикам и удобными несколькими сайтами клонирования для получения полицистронных векторов, позволяющих экспрессировать до восьми белков. Эти источники имеют разное количество копий и могут использоваться в различных комбинациях для достижения сбалансированных уровней экспрессии целевых белков21. Для проверки белок-белковых взаимодействий используются различные аффинные метки; наиболее распространенными являются 6xгистидин, глутатион-S-трансфераза (GST) и мальтозосвязывающий белок (MBP), каждый из которых имеет специфическое сродство к соответствующей смоле. GST и MBP также повышают растворимость и стабильность меченых белков22.

Также был разработан ряд методов, включающих коэкспрессию белка в эукариотических клетках, наиболее известным из которых является двухгибридный анализ дрожжей (Y2H)23. Анализ Y2H дешев, прост и позволяет тестировать несколько взаимодействий; Однако его рабочий процесс занимает более 1 недели. Существует также несколько менее часто используемых анализов на основе клеток млекопитающих, например, флуоресцентный двухгибридный анализ (F2H)24 и анализ белково-белкового взаимодействия клеточного массива (CAPPIA)25. Анализ F2H является относительно быстрым, что позволяет наблюдать белковые взаимодействия в их родной клеточной среде, но требует использования дорогостоящего оборудования для визуализации. Все эти методы имеют преимущество перед прокариотической экспрессией, обеспечивая нативную эукариотическую среду трансляции и складывания; Однако они обнаруживают взаимодействие косвенно, либо путем активации транскрипции, либо путем флуоресцентного переноса энергии, что часто приводит к артефактам. Кроме того, эукариотические клетки могут содержать других партнеров по взаимодействию интересующих белков, что может мешать тестированию бинарных взаимодействий между белками высших эукариот.

В настоящем исследовании описывается метод бактериальной коэкспрессии дифференциально меченных белков с последующим использованием традиционных методов вытягивания. Метод позволяет изучать взаимодействия между белками-мишенями, требующими коэкспрессии. Он более эффективен по времени по сравнению с традиционным вытягиванием, позволяя проводить пакетное тестирование нескольких целей, что делает его выгодным в большинстве случаев. Коэкспрессия с использованием совместимых векторов более удобна, чем полицистронная коэкспрессия, поскольку не требует трудоемкого этапа клонирования.

Protocol

Схематическое изображение рабочего процесса метода показано на рисунке 1. 1. Котрансформация кишечной палочки Подготовьте векторы экспрессии для белков-мишеней, используя стандартные методы клонирования.ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, хо?…

Representative Results

Описанный метод обычно использовался со многими различными целями. Здесь представлены некоторые репрезентативные результаты, которые, вероятно, не могут быть получены с использованием обычных методов вытягивания. Во-первых, это изучение димеризации специфического ZAD (домена, связанн?…

Discussion

Описанный метод позволяет тестировать белок-белковые взаимодействия, которые не могут быть эффективно собраны in vitro и требуют коэкспрессии. Метод является одним из немногих подходящих подходов для изучения гетеродимеризирующих белков, которые также способны к гомодимеризации, т…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Работа выполнена при поддержке проектов РНФ 19-74-30026 (разработка и валидация метода) и 19-74-10099 (анализ белково-белкового взаимодействия); грант Министерства науки и высшего образования Российской Федерации 075-15-2019-1661 (анализ репрезентативных белок-белковых взаимодействий).

Materials

8-ELEMENT probe Sonics 630-0586 The high throughput 8-element sonicator probes
Agar AppliChem A0949
Amylose resin New England Biolabs E8021 Resin for purification of MBP-tagged proteins
Antibiotics AppliChem A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin)
Beta-mercaptoethanol AppliChem A1108
BL21(DE3)  Novagen 69450-M
CaCl2 AppliChem A4689
Centrifuge Eppendorf 5415R (Z605212)
Glutathione AppliChem A9782
Glutathione agarose Pierce 16100 Resin for purification of GST-tagged proteins
Glycerol AppliChem A2926
HEPES  AppliChem A3724
HisPur Ni-NTA Superflow Agarose Thermo Scientific 25214 Resin for purification of 6xHis-tagged proteins
Imidazole AppliChem A1378
IPTG AppliChem A4773
KCl AppliChem A2939
LB AppliChem 414753
Maltose AppliChem A3891
MOPS AppliChem A2947
NaCl AppliChem A2942
NP40 Roche 11754599001
pACYCDuet-1 Sigma-Aldrich 71147 Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin
pCDFDuet-1 Sigma-Aldrich 71340 Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin
PMSF AppliChem A0999
Protease Inhibitor Cocktail VII Calbiochem 539138 Protease Inhibitor Cocktail
pRSFDuet-1 Sigma-Aldrich 71341 Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin
SDS  AppliChem A2263
Tris  AppliChem A2264
VC505 sonicator Sonics CV334 Ultrasonic liquid processor
ZnCl2 AppliChem A6285

References

  1. Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. Protein-protein interactions: Pulldown assays. Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).
  2. Rose, R. B., et al. Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).
  3. Bonchuk, A., et al. Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila. Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).
  4. Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112 (2), 193-205 (2003).
  5. Badonyi, M., Marsh, J. A. Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly. Elife. 11, 79602 (2022).
  6. Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
  7. Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755 (2021).
  8. Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
  9. Shieh, Y. W., et al. Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria. Science. 350 (6261), 678-680 (2015).
  10. Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), 57-64 (2021).
  11. Bonchuk, A. N., et al. Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity. Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).
  12. Justin, N., et al. Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2. Nature Communications. 7, 11316 (2016).
  13. Lariviere, L., et al. Structure of the mediator head module. Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).
  14. Taylor, N. M., et al. Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction. Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).
  15. Samara, N. L., et al. Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module. Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).
  16. Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module. Cell. 141 (4), 606-617 (2010).
  17. Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems. Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).
  18. Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids. Cell. 32 (1), 119-129 (1983).
  19. Nijkamp, H. J., et al. The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13. Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).
  20. Som, T., Tomizawa, J. Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030. Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).
  21. Tsao, K. L., Waugh, D. S. Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase. Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).
  22. Nallamsetty, S., Waugh, D. S. Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners. Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).
  23. Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).
  24. Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells. Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).
  25. Fiebitz, A., et al. High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays. BMC Genomics. 9, 68 (2008).
  26. Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins. Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).
  27. Maksimenko, O., et al. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).
  28. Sabirov, M., et al. Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster. Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).
  29. Dong, S., Provart, N. J. Analyses of protein interaction networks using computational tools. Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).

Play Video

Cite This Article
Bonchuk, A., Zolotarev, N., Balagurov, K., Arkova, O., Georgiev, P. Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (190), e64541, doi:10.3791/64541 (2022).

View Video