Un saggio di fluorescenza del calcio "a doppia aggiunta" per lo screening ad alta produttività dei recettori accoppiati a proteine G ricombinanti

I recettori accoppiati a proteine G (GPCR), che sono presenti dal lievito all’uomo, rappresentano la più grande superfamiglia di recettori in molti organismi¹. Svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione di quasi tutti i processi biologici negli animali. Ci sono 50-200 GPCR nel genoma degli artropodi, il che significa che rappresentano la più grande superfamiglia di recettori di membrana². Sono classificati in sei classi principali, A-F, in base alla loro somiglianza di sequenza e alle funzioni³. I GPCR trasducono vari segnali extracellulari, come quelli di ormoni, neuropeptidi, ammine biogene, glutammato, protone, lipoglicoproteine e fotoni⁴. I GPCR si accoppiano alle proteine G eterotrimere (Gα, Gβ e Gγ) per trasmettere segnali a valle. I GPCR accoppiati alle proteine Gα_s o Gα i/o aumentano o diminuiscono, rispettivamente, i livelli intracellulari di adenosina monofosfato (cAMP) ciclico 3′, 5′ attivando_o inibendo l’adenilil ciclasi. I GPCR accoppiati a Gα_q/11 inducono il rilascio di calcio dalle riserve di calcio del reticolo endoplasmatico attivando la via della fosfolipasi C (PLC)-inositolo-1,4,5-trifosfato (IP₃). I GPCR accoppiati a Gα_12/13 attivano i fattori di scambio nucleotidico della RhoGTPasi ^5,6. I GPCR sono il bersaglio di oltre il 50% dei farmaci umani e di un acaricida, amitraz⁴. Poiché i GPCR trasducono segnali così diversi, sono obiettivi promettenti per lo sviluppo di nuovi pesticidi che interrompono le funzioni fisiologiche specifiche degli invertebrati.

L’obiettivo di HTS è identificare molecole colpite in grado di modulare le funzioni dei recettori. HTS comporta lo sviluppo di saggi, la miniaturizzazione e l’automazione⁷. I GPCR neuropeptidici artropodi sono coinvolti nella maggior parte delle funzioni fisiologiche, come lo sviluppo, la muta e l’ecdisi, l’escrezione, la mobilitazione di energia e la riproduzione⁴. La maggior parte dei GPCR neuropeptidici di artropodi e metazoi segnalano attraverso la cascata di segnalazione del calcio 2,6,8,9,10^, come nel peptide mioinibitorio e nei recettori SIFamide della zecca dalle zampe nere Ixodes scapularis; i loro ligandi sono antagonisti nei saggi di motilità dell’intestino posteriore, con SIF che provoca contrazione e MIP che lo inibisce^11,12. Un recettore NPY-simile della zanzara della febbre gialla, Aedes aegypti, regola l’ospite femminile in cerca di¹³. Rispetto ad altri saggi alternativi di mobilizzazione del calcio come il saggio di bioluminescenza del calcio aequorina¹⁴, il test di fluorescenza del calcio è facile da eseguire, non richiede la trasfezione di altre proteine ricombinanti di rilevamento del calcio ed è conveniente. Il saggio di fluorescenza del calcio produce un segnale prolungato rispetto al segnale cinetico veloce ottenuto nel saggio di bioluminescenza del calcio dell’aquorina^14,15.

Nell’esempio qui, il recettore della chinina dalla zecca della febbre bovina, Rhipicephalus microplus, è stato espresso in modo ricombinante nella linea cellulare CHO-K1 e utilizzato per il saggio di fluorescenza del calcio. C’è solo un gene del recettore della chinina trovato in R. microplus; il recettore segnala attraverso una via di segnalazione dipendente dalla proteina Gq e innesca l’efflusso di Ca²⁺ dalle riserve di calcio nello spazio intracellulare¹⁶. Questo processo può essere rilevato e quantificato da un fluoroforo, che suscita un segnale di fluorescenza quando si legano gli ioni calcio (Figura 1).

Il recettore della chinina è un GPCR specifico per invertebrati, che appartiene ai recettori simili alla rodopsina di classe A. La kinina è un antico neuropeptide di segnalazione presente in molluschi, crostacei, insetti e Acari 4,17,18. I coleotteri (coleotteri) mancano del sistema di segnalazione della chinina; nella zanzara Aedes aegypti, c’è solo un recettore della chinina che lega tre aedeskinine, mentre Drosophila melanogaster ha un recettore della chinina con drosochinina come unico ligando 19,20,21. Non ci sono chinine omologhe o recettori della chinina nei vertebrati. Sebbene l’esatta funzione della chinina sia sconosciuta nelle zecche, le femmine silenziate dal recettore della kinina RNAi di R. microplus mostrano una capacità riproduttiva significativamente ridotta²². Le chinine sono peptidi pleotropici negli insetti. In Drosophila melanogaster, sono coinvolti sia nel sistema nervoso centrale che periferico^{regolatore 23}, pre-ecdisis²⁴, alimentazione²⁵, metabolismo 26 e modelli di attività del sonno^26,27, così come locomozione larvale²⁸. Le chinine regolano la contrazione dell’intestino posteriore, la diuresi e l’alimentazione nella zanzara A. aegypti 29,30,31. I peptidi di chinina hanno un pentapeptide C-terminale conservato Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH₂, che è la sequenza minima richiesta per l’attività biologica³². La specificità degli artropodi, le piccole dimensioni del ligando endogeno, che li rende suscettibili di interferenze di piccole molecole, e le funzioni pleiotropiche negli insetti rendono il recettore della chinina un bersaglio promettente per il controllo dei parassiti⁴.

Il saggio di “doppia addizione” (figura 2) consente l’identificazione di agonisti o antagonisti nello stesso saggio HTS¹⁵. È adattato da un test di “doppia addizione” comunemente usato nell’industria farmaceutica per la scoperta di farmaci³³. In breve, la prima aggiunta di farmaci nella piastra cellulare consente l’identificazione di potenziali agonisti nella libreria chimica quando viene rilevato un segnale di fluorescenza superiore rispetto all’applicazione del controllo del solvente. Dopo 5 minuti di incubazione con queste piccole molecole, un noto agonista (peptide di chinina) viene applicato a tutti i pozzetti. Quei pozzetti che hanno ricevuto casualmente un antagonista dalla piastra del farmaco mostrano un segnale di fluorescenza inferiore all’aggiunta dell’agonista rispetto ai pozzetti di controllo che hanno ricevuto il solvente nella prima aggiunta. Questo test consente quindi l’identificazione di potenziali agonisti e antagonisti con le stesse cellule. In un progetto HTS standard, queste molecole colpite sarebbero ulteriormente convalidate attraverso saggi dose-risposta e da ulteriori saggi di attività biologica, che non sono mostrati qui.

Figura 1: Illustrazione del meccanismo di analisi della fluorescenza del calcio. La proteina Gq innesca la via di segnalazione intracellulare del calcio. Il recettore della chinina (recettore accoppiato alla proteina G) è stato espresso in modo ricombinante nelle cellule CHO-K1. Quando il ligando agonista si lega al recettore, la proteina Gq associata al recettore della chinina attiva PLC, che catalizza la conversione di una molecola PIP₂ in IP₃ e DAG. L’IP 3 si lega quindi all’IP₃R sulla superficie del reticolo endoplasmatico, portando al rilascio di Ca 2+ nel citoplasma, dove gli ioni Ca ²⁺ si legano ai fluorofori e suscitano un segnale di fluorescenza. Il segnale di fluorescenza può essere ottenuto per eccitazione a 490 nm e rilevato a 514 nm. Abbreviazioni: GPCR = G protein-coupled receptor; PLC = fosfolipasi C; PIP₂ = fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato; IP₃ = inositolo trisfosfato; DAG = diacilglicerolo; IP3 R = recettore IP₃. Creato con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Il flusso di lavoro per lo screening ad alta produttività di piccole molecole su un recettore accoppiato a proteine G espresso in cellule CHO-K1. (A) Le cellule CHO-K1 ricombinanti che esprimono stabilmente il recettore della chinina sono state aggiunte alla piastra a 384 pozzetti (10.000 cellule/pozzetto) utilizzando un sistema di manipolazione dei liquidi (25 μL/pozzetto) e incubate in un incubatore di CO₂ umidificato per 12-16 ore. (B ) Il tampone di analisi contenente il colorante fluorescente (25 μL/pozzetto) è stato aggiunto nella piastra cellulare utilizzando un sistema di manipolazione del liquido. La piastra è stata incubata per 30 minuti a 37 °C per 30 minuti ed equilibrata a RT per altri 30 minuti. (C) Il segnale di fluorescenza di fondo delle cellule in ciascun pozzetto è stato misurato con un lettore di piastre. (D) Soluzioni farmacologiche da una piastra di libreria a 384 pozzetti e solvente bianco (tutti a 0,5 μL / pozzetto) sono stati aggiunti nella piastra di analisi cellulare utilizzando un sistema di manipolazione dei liquidi. (E) Le risposte cellulari alla fluorescenza del calcio sono state misurate con il lettore di piastre immediatamente dopo l’aggiunta delle soluzioni farmacologiche; I composti che hanno suscitato segnali di fluorescenza superiori alla media sono stati individuati come hit agonisti. I colpi antagonisti che bloccano il GPCR (icona sotto) sono stati rivelati dopo l’aggiunta dell’agonista del peptide durante la fase G. (F) Nella stessa piastra di analisi, dopo 5 minuti di incubazione delle cellule con composti di screening, un peptide agonista endogeno Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) del recettore della chilina delle zecche è stato aggiunto a ciascun pozzetto (1 μM). (G) Le risposte di fluorescenza cellulare dopo l’aggiunta di peptidi agonista sono state misurate immediatamente dal lettore di piastre. I composti che inibiscono il segnale di fluorescenza sono stati selezionati come hit antagonisti. Abbreviazioni: GPCR = G protein-coupled receptor; RT = temperatura ambiente; RFU = unità di fluorescenza relativa. Creato con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.