In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die in vitro Selektion von technisch hergestellten Transkriptionsrepressoren (ETRs) mit hoher, langfristiger, stabiler On-Target-Silencing-Effizienz und geringer genomweiter Off-Target-Aktivität vor. Dieser Arbeitsablauf ermöglicht es, ein anfängliches, komplexes Repertoire von ETR-Kandidaten auf eine kurze Liste zu reduzieren, die für die weitere Evaluierung in therapeutisch relevanten Umgebungen geeignet ist.
Die Geninaktivierung ist entscheidend für die Untersuchung der Genfunktion und stellt eine vielversprechende Strategie für die Behandlung eines breiten Spektrums von Krankheiten dar. Unter den traditionellen Technologien leidet die RNA-Interferenz unter der teilweisen Aufhebung des Ziels und der Notwendigkeit lebenslanger Behandlungen. Im Gegensatz dazu können künstliche Nukleasen eine stabile Geninaktivierung durch Induktion eines DNA-Doppelstrangbruchs (DSB) bewirken, aber neuere Studien stellen die Sicherheit dieses Ansatzes in Frage. Eine gezielte epigenetische Editierung mittels künstlich hergestellter Transkriptionsrepressoren (ETRs) könnte eine Lösung darstellen, da eine einmalige Verabreichung spezifischer ETR-Kombinationen zu einer dauerhaften Stilllegung führen kann, ohne DNA-Brüche zu induzieren.
ETRs sind Proteine, die eine programmierbare DNA-Bindungsdomäne (DBD) und Effektoren von natürlich vorkommenden Transkriptionsrepressoren enthalten. Insbesondere wurde gezeigt, dass eine Kombination von drei ETRs, die mit der KRAB-Domäne von humanem ZNF10, der katalytischen Domäne von humanem DNMT3A und humanem DNMT3L, ausgestattet sind, vererbbare repressive epigenetische Zustände auf dem ETR-Zielgen induziert. Die Hit-and-Run-Natur dieser Plattform, die fehlende Beeinflussung der DNA-Sequenz des Ziels und die Möglichkeit, bei Bedarf durch DNA-Demethylierung in den repressiven Zustand zurückzukehren, machen das epigenetische Silencing zu einem bahnbrechenden Werkzeug. Ein kritischer Schritt ist die Identifizierung der richtigen Position der ETRs auf dem Zielgen, um das On-Target-Tracking zu maximieren und das Off-Target-Silencing zu minimieren. Die Durchführung dieses Schritts in der endgültigen präklinischen Ex-vivo- oder In-vivo-Umgebung kann umständlich sein.
Ausgehend vom CRISPR/katalytisch toten Cas9-System als paradigmatische DBD für ETRs beschreibt diese Arbeit ein Protokoll, das aus dem In-vitro-Screening von guide-RNAs (gRNAs) besteht, die an die Triple-ETR-Kombination gekoppelt sind, um ein effizientes On-Target-Silencing zu ermöglichen, gefolgt von der Bewertung des genomweiten Spezifitätsprofils von Top-Treffern. Dies ermöglicht es, das anfängliche Repertoire an gRNA-Kandidaten auf eine kurze Liste vielversprechender gRNAs zu reduzieren, deren Komplexität für ihre abschließende Bewertung im therapeutisch relevanten Setting von Interesse geeignet ist.
Die Geninaktivierung spielt traditionell eine Schlüsselrolle bei der Untersuchung der Genfunktion sowohl in Zell- als auch in Tiermodellen. Darüber hinaus wurde sie in den letzten zwei Jahrzehnten mit dem Aufkommen der Gentherapie als potenziell bahnbrechender Ansatz zur Behandlung von Krankheiten vorgeschlagen, die durch Gain-of-Function-Mutationen1, Infektionskrankheiten2 oder Pathologien verursacht werden, bei denen die Stilllegung eines Gens einen erblichen Defekt in einem anderen kompensieren kann3. Schließlich wurde die genetische Inaktivierung von Schlüsselregulatoren der Zellfitness und der funktionellen Kontrolle vorgeschlagen, um die Effizienz von Zellprodukten für die Krebsimmuntherapie4 und die regenerative Medizin5 zu verbessern.
Unter den verschiedenen Technologien zur Geninaktivierung ist eine der vielversprechendsten das gezielte epigenetische Silencing 6,7. Kern dieser Technologie sind die sogenannten Engineered Transcriptional Repressors (ETRs), chimäre Proteine, die aus einer programmierbaren DNA-Bindungsdomäne (DBD) und einer Effektordomäne (ED) mit epigenetischer Repressionsfunktion bestehen. Zinkfingerproteine (ZFPs)8, Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektoren (TALEs)9 oder CRISPR/dCas910-basierte DBDs können so konzipiert werden, dass sie die ED selektiv an die Promotor-/Enhancer-Sequenz des Zielgens binden, das stillgelegt werden soll. Dort angekommen, übt die ED der ETR ihre Silencing-Aktivität aus, indem sie heterochromatin-induzierende repressive epigenetische Markierungen wie Histonmodifikationen (H3K9 11,12 oder H3K27 13-Methylierung,H3– oder H4-Deacetylierung14) und CpG-DNA-Methylierung 15 auferlegt, je nach verwendeter repressiver Domäne.
Insbesondere inspiriert von den molekularen Prozessen der permanenten transkriptionellen Repression endogener Retroviren, die im Präimplantationsembryoauftreten 16, wurde eine Kombination von drei ETRs generiert, um die folgenden EDs zu nutzen: i) die Krüppel-assoziierte Box (KRAB)-Domäne von humanem ZNF10; ii) die katalytische Domäne der humanen de novo DNA-Methyltransferase 3A (DNMT3A); und iii) die humane DNA-Methyltransferase 3-like (DNMT3L) in voller Länge. KRAB ist eine konservierte repressive Domäne, die von mehreren ZFPs in höheren Wirbeltieren geteilt wird17,18, deren Silencing-Aktivität hauptsächlich auf ihrer Fähigkeit beruht, KAP1 19 zu rekrutieren – ein Gerüstprotein, das dann mit mehreren anderen Heterochromatin-Induktoren20 interagiert – einschließlich des Nukleosomen-Remodeling- und Deacetylierungskomplexes (NuRD) 21, der H3K9-Histon-Methyltransferase SETDB122 und des H3K9-Methylierungslesers HP1 23, 24, unter anderem.
DNMT3A überträgt aktiv Methylgruppen auf die DNA an CpG-Sequenzen25. Die katalytische Aktivität von DNMT3A wird durch seine physikalische Assoziation mit DNMT3L verstärkt, einem embryo- und keimzellbeschränkten Paralog von DNMT3A, dem die katalytische Domäne fehlt, die für den Methylgruppentransfer verantwortlich ist26,27. Die DNA-Methylierung an CpG-reichen Regionen, die als CpG-Inseln (CGIs) bezeichnet werden, die in die Promotor-/Enhancer-Elemente von Säugetiergenen eingebettet sind, ist in der Regel mit Transkriptions-Silencing assoziiert28. Wichtig ist, dass die CpG-Methylierung, sobald sie abgeschieden ist, während der gesamten Mitose durch einen UHRF1-DNMT1-basierten molekularen Komplex stabil vererbt werdenkann 29.
Eine stabile Überexpression der ETRs in der Zielzelle kann problematisch sein, wahrscheinlich aufgrund des zunehmenden Risikos einer Off-Target-Aktivität und der Verdrängung endogener Interaktoren von ihren physiologischen Zielorten im Laufe der Zeit. Die vorübergehende Expression von Einzel-ETR-Einheiten kann jedoch keine langfristige Stilllegung mit hoher Effizienz induzieren30, was ihre therapeutische Anwendung behindert. Daher war ein bahnbrechender Durchbruch auf diesem Gebiet der Nachweis, dass die Kombination der drei KRAB-, DNMT3A- und DNMT3L-basierten ETRs synergistisch wirken und, selbst wenn sie nur vorübergehend zusammen verabreicht werden, die Promotorsequenz des Zielgens H3K9 und die CpG-Methylierung beeinflussen kann. Diese werden dann von der Zelle während der gesamten Mitose abgelesen und vermehrt, was zu einer vererbbaren Stilllegung in mehreren menschlichen und murinen Zelllinien sowie in ex vivo kultivierten Primärzellen führt30.
Bemerkenswert ist, dass die epigenetische Stummschaltung, die durch die ETRs auferlegt wird, bei Bedarf durch gezielte (z. B. Rekrutierung der CRISPR/dCas9-basierten TET1-DNA-Demethylase auf dem stillgelegten Locus) oder pharmakologische (Verabreichung des DNA-Methyltransferase-Inhibitors 5-Aza) DNA-Demethylierung rückgängig gemacht werdenkann 30, ein potenzielles Gegenmittel im Falle von ETR-bedingten unerwünschten Ereignissen. All-in-One-ETRs mit den drei KRAB-, DNMT3A- und DNMT3L-basierten EDs wurden ebenfalls beschrieben und zeigten signifikante Silencing-Effizienzen in Zelllinien31,32 gegenüber der großen Mehrheit der proteinkodierenden Gene. Darüber hinaus berichteten mehrere Studien, in denen die ETRs verwendet wurden, über ein hohes Sicherheitsprofil ohne größere Off-Target-Aktivität in Bezug auf die De-novo-CpG-Methylierung oder die Veränderung der Chromatinzugänglichkeit30,31,32. Vor klinischen Anwendungen wird jedoch eine dedizierte Analyse des Spezifitätsprofils von ETRs empfohlen, die mit einer neu gestalteten DBD ausgestattet sind.
Aus klinischer Sicht kann gezieltes epigenetisches Silencing entscheidende Vorteile sowohl für den RNA-Interferenz (RNAi)-basierten Knockdown33 als auch für die künstliche Nuklease-basierte Genstörungbieten 8. Im Gegensatz zu RNAi kann das gezielte epigenetische Silencing die vollständige Aufhebung seines Ziels pro Zelle induzieren und erfordert keine regelmäßige Behandlung, um ein langfristiges Silencing zu gewährleisten. Im Gegensatz zur Genstörung bleibt die DNA-Sequenz unverändert, wodurch die Entstehung von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) vermieden wird. DSBs können dann Apoptose und Zellzyklusarrest induzieren, was möglicherweise zu einer Selektion gegen Zellen mit einem funktionellen p53-Signalwegführt 34,35 und, insbesondere in Multiplex-Geneditierungsumgebungen, zu chromosomalen Umlagerungen 35. Darüber hinaus kann die Genstörung durch die Weiterleitung des irreversiblen Mosaikergebnisses der nicht-homologen Endverknüpfungs-vermittelten DNA-DSB-Reparatur36 die In-Frame-Reparatur des Ziels in funktionelle kodierende Sequenzen als eines der Endergebnisse nicht vermeiden und kann im Gegensatz zum epigenetischen Silencing nicht bei Bedarf gelöscht werden.
Schließlich birgt epigenetisches Silencing das Potenzial, das Spektrum der anvisierbaren genetischen Elemente auf Klassen zu erweitern, die vollständig oder zumindest teilweise refraktär gegenüber RNAi und Genstörungen sind, wie z. B. nicht-transkribierte regulatorische Elemente und nicht-kodierende RNAs30,32. Der erste kritische Schritt für jede gezielte epigenetische Silencing-Anwendung besteht darin, ein Panel von ETRs zu entwerfen, das die verschiedenen regulatorischen Sequenzen des Zielgens abdeckt, und die leistungsstärksten zu identifizieren. Die Anzahl der zu testenden ETRs kann entscheidend sein, wenn man den wachsenden Anteil des Genoms bedenkt, auf den die programmierbaren DNA-Bindungstechnologien abzielen, die sich ständig in der Entwicklung befinden37. Das Screening der ETRs direkt auf dem Zelltyp durchzuführen, in dem das Zielgen therapeutisch stillgelegt werden soll, wäre die relevanteste Option. Hochdurchsatz-Screenings können jedoch aufgrund ihres begrenzten Überlebens in Kultur und ihrer oft suboptimalen technischen Kapazität in Primärzellen technisch umständlich sein. Großflächige Bildschirme können in vivo noch undurchführbarer sein.
Eine praktikablere Alternative besteht darin, zunächst ein großes Panel von ETRs in leicht herzustellenden Zelllinien durchzuführen und dann nur die vielversprechendsten in dem therapeutisch relevanten Zelltyp zu validieren. Ein paralleles Problem ist die Auswahl eines geeigneten Messwerts zur Messung der Silencing-Effizienz der ETRs. Die direkte Bewertung der Transkript- oder Proteinspiegel des Zielgens mittels RT-qPCR, Western Blot oder ELISA kann kostspielig und zeitaufwändig sein und möglicherweise nicht ausreichend empfindlich sein, was ihre Anwendung im Hochdurchsatzmaßstab einschränkt. Die Generierung von ad hoc modifizierten Reporterzelllinien, in denen ein Fluorophor unter die transkriptionelle Kontrolle der regulatorischen Sequenzen des Zielgens gestellt wird, ermöglicht die Nutzung des auf Durchflusszytometrie basierenden Ansatzes, um epigenetisches Silencing auf Einzelzellebene und mit hoher Durchsatzgeschwindigkeit zu lesen.
Im Anschluss an diese allgemeinen Überlegungen wird in dieser Arbeit ein Protokoll beschrieben, das aus dem in vitro angeordneten Screening von ETRs auf On-Target-Silencing-Effizienz besteht, gefolgt von der Bewertung der genomweiten Off-Target-Aktivität der Top-Hits. Dieser Workflow ermöglicht es, das anfängliche Repertoire an ETR-Kandidaten auf eine kurze Liste vielversprechender ETRs zu reduzieren, deren Komplexität für ihre endgültige Bewertung in dem therapeutisch relevanten Zelltyp von Interesse geeignet ist.
Unter den verschiedenen programmierbaren DBDs, die zur Generierung von ETRs genutzt werden können, wird sich dieses Protokoll auf die CRISPR/dCas9-basierte Technologie konzentrieren, da es einfach ist, gRNAs zu entwerfen, die den Zielgenpromotor in einem Hochdurchsatzmaßstab umfassen. Der gleiche konzeptionelle Workflow, der im Folgenden beschrieben wird, kann jedoch verwendet werden, um die Effizienz und Spezifität von ETRs zu bewerten, die mit anderen DBDs ausgestattet sind.
Gezieltes epigenetisches Silencing kann eine vielversprechende Lösung zur Behandlung von Erkrankungen darstellen, die von einer dauerhaften Geninaktivierung profitieren können, einschließlich Krankheiten, die durch Gain-of-Function-Mutationen1 verursacht werden, Infektionskrankheiten2 und Pathologien, bei denen die Stilllegung eines Gens entweder einen erblichen Defekt in einem anderen Gen kompensieren kann3 oder das volle Potenzial adoptiver Zelltherapien freisetzenkann 4. 5. Anmelden Durch die Wirkung auf Chromatinebene und die Autovermehrung durch die Zelle 7,30,32 kann epigenetisches Silencing toxische Veränderungen (z. B. chromosomale Umlagerungen) der DNA-Sequenz des Zielgens und partielles, vorübergehendes Silencing des Ziels vermeiden, die Einschränkungen der künstlichen Nuklease-basierten Genstörung8,34,35 bzw. RNAi-basierter Knockdown 33 sind.
Einer der wichtigsten vorbereitenden Schritte in jedem epigenetischen Silencing-Protokoll besteht darin, die richtige Position auf dem Zielgen zu identifizieren, um die ETRs zu steuern, die die repressiven epigenetischen Markierungen hinterlassen, die notwendig sind, um die Transkriptionsaktivität des Ziels auszuschalten. Unterschiedliche transkriptionelle Startstellen-proximale und -distale regulatorische Elemente können zusammenwirken, um die Transkriptionsleistung eines gegebenen menschlichen Genszu unterstützen 54. Darüber hinaus können dank der wachsenden Anzahl programmierbarer DNA-Bindungstechnologien nun unterschiedliche Zielorte pro spezifischem regulatorischem Element identifiziert werden6. Daher können Protokolle, wie das hier beschriebene in gentechnisch veränderten Zelllinien, verwendet werden, um einzelne Zielorte und/oder genomische Regionen zu nominieren, die für ETR-vermitteltes epigenetisches Silencing zugänglich sind, bevor man sich auf die umständliche und zeitaufwändige Bewertung der besten Kandidaten in der endgültigen therapeutischen Umgebung einlässt. Einige kritische Aspekte des Protokolls werden im Folgenden näher beschrieben.
Entwicklung einer Reporterzelllinie, die das endgültige therapeutische Ziel vorhersagt
Trotz der ständigen Optimierung der Cell-Engineering-Protokolle, die hier erforderlich sind, um die für den Fluoreszenzreporter kodierende Kassette in das Zielgen einzufügen und die ETRs zu liefern, kann nicht davon ausgegangen werden, dass sie bereits für die Zelllinie verfügbar sind, die dem endgültigen therapeutischen Ziel am ähnlichsten ist. In diesem Fall können verschiedene Minderungsstrategien angewendet werden: a) Nutzung von Optimierungskits, die von Anbietern zur Verfügung gestellt werden, um das Transfektionsprotokoll für die Zielzelllinie intern zu optimieren; b) Wechsel zu anderen Zelllinien, die immer noch dieses Zielgen exprimieren, aber zu anderen Geweben als dem endgültigen therapeutischen Ziel gehören – für die die technischen Protokolle umfassend optimiert wurden. Falls diese Optionen nicht verfügbar sind, kann man in Betracht ziehen, auf primäre Zelltypen oder Organoide umzusteigen, die das endgültige Ziel darstellen. Als generelle Überlegung sowohl für präklinische Studien als auch für therapeutische Anwendungen des ETR-basierten epigenetischen Silencings sollten Szenarien, in denen das Zielgen für den Zielzelltyp essentiell ist, verworfen werden. Die vollständige, langfristige Stilllegung eines essentiellen Gens, das durch die ETRs auferlegt wird, führt im Laufe der Zeit zu einer Gegenselektion der Zielzellen (und möglicherweise zu einer Toxizität der Behandlung). Alternative Technologien, die eine partielle Target-Abrogation ermöglichen, wie RNAi33, werden in diesen Fällen bevorzugt.
Evaluierung der zielgerichteten Silencing-Aktivität der ETRs
ETRs, die auf der Kombination von KRAB-, DNMT3A- und DNMT3L-Effektordomänen basieren, haben sich als wirksam gegen die große Mehrheit der proteinkodierenden Gene erwiesen, mit einem breiten permissiven Zielfenster von etwa 1 Kilobase lang, das auf der Transkriptionsstartstelle zentriertist 32. Um ein Gefühl dafür zu bekommen, wie ein gut durchgeführtes epigenetisches Silencing-Experiment aussieht, werden hier die technischen Details und Ergebnisse der Stummschaltung des B2M-Gens in K-562-Zellen vorgestellt. Dies kann als eine wichtige Positivkontrolle angesehen werden, die nicht nur von Forschern, die mit K-562-Zellen arbeiten, einbezogen werden sollte, sondern auch von denen, die sich zum ersten Mal der ETR-basierten Technologie nähern. Wie im Protokoll angegeben, wird eine künstliche Nuklease (z. B. CRISPR/Cas9)-basierte Genstörung als zusätzliche Kontrolle sowohl der Effizienz der Genübertragung in dem interessierenden Zelltyp als auch des Phänotyps von Zellen, denen das Zielgen entzogen wurde, empfohlen. Wenn nach dem anfänglichen Screening der zu koppelnden gRNAs mit den CRISPR/dCas9-basierten ETRs keine der getesteten gRNAs in der Lage ist, das Zielgen dauerhaft zum Schweigen zu bringen, sollte man in der folgenden Reihenfolge in Betracht ziehen: 1) Erhöhung der Menge der abgegebenen gRNAs und ETRs; 2) Testpools der Top-gRNAs auf der Suche nach synergistischen Effekten zwischen ihnen. Wenn ein langfristiges Silencing immer noch nicht erreicht ist, sollte man Folgendes in Betracht ziehen: 3) das Testen zusätzlicher gRNAs, die möglicherweise auf Stellen abzielen, die für die Anweisung des epigenetischen Silencings relevanter sind; 4) Umstellung auf ZFP8– oder TALE9-basierte DBD-Plattformen, die möglicherweise eine verbesserte Bindungskapazität an das Zielchromatin aufweisen; 5) Umschaltung von transient auf stabil – z.B. Integration der viralen vektorbasierten Expression der ETRs (entweder der gRNA oder der dCas9-Fusionskonstrukte oder beides bei Anwendung der CRISPR/dCas9-Technologie). Da unsere Gruppe die gemeinsame Bereitstellung der drei separaten ETRs30 entwickelt hat und über solide Erfahrungen damit verfügt, basieren das Protokoll und die hier gezeigten Ergebnisse auf diesem Ansatz. Ein ähnlicher konzeptioneller Arbeitsablauf kann jedoch wahrscheinlich für ein All-in-One-CRISPR-basiertes System32 angewendet werden.
Evaluierung der Off-Target-Aktivität der ETRs
Mehrere Studien haben vorläufige Indikationen für die Spezifität von ETRs gezeigt, die auf der Kombination von KRAB-, DNMT3A- und DNMT3L-Effektordomänen basieren30,31,32. Wenn jedoch keine der getesteten gRNAs ein zufriedenstellendes Spezifitätsprofil in Bezug auf die Transkriptionsregulation und/oder die De-novo-DNA-Methylierung aufweist, kann man zwei sich nicht gegenseitig ausschließende Strategien verfolgen: a) Verkürzung der Verweilzeit der ETRs in der Zelle (und damit ihrer potenziellen Off-Target-Aktivität), indem entweder die Dosen der ETRs verringert oder alternative Verabreichungssysteme getestet werden. Im Vergleich zu Plasmiden wird beispielsweise erwartet, dass sowohl die mRNA- als auch die Proteinabgabe die Zellexpositionszeit gegenüber den ETRs und damit die Wahrscheinlichkeit einer Off-Target-Aktivität verringern55; b) Umschalten auf neuere Cas9-Varianten, die optimiert sind, um die Off-Target-Bindung der Plattform56 zu reduzieren, oder auf alternative ZFP8– oder TALE9-basierte DNA-Bindungstechnologien. Es ist wichtig zu berücksichtigen, dass im Vergleich zu simulierten Proben die On-Target- und die Off-Target-Aktivität des Gen-Silencings nicht nur durch die Bindung der DBD an ihre Zielsequenz beeinflusst werden, sondern auch durch die potenzielle Fähigkeit der epigenetischen Effektordomänen, durch ihre natürlichen, endogenen Cofaktoren an andere Loci rekrutiert zu werden. Daher kann eine Verkürzung der Verweilzeit der ETRs in der Zielzelle nicht nur die Wahrscheinlichkeit einer Bindung der DBD an Off-Target-Stellen verringern, sondern auch die Wahrscheinlichkeit, dass die ETRs mit endogenen Cofaktoren interagieren, mit potenziellen Vorteilen in Bezug auf Spezifität und Nachteilen in Bezug auf die On-Target-Aktivität. Schließlich können im Vergleich zu simulierten Proben einige der transkriptionellen und weniger wahrscheinlichen CpG-Methylierungsveränderungen, die in stillgelegten Zellen gemessen wurden, einfach durch den Entzug des Zielgens abgeleitet werden. Diese werden nicht als Off-Targets der Silencing-Technologie betrachtet. Um sie zu identifizieren, sollte man auch die Genstörung durch künstliche Nuklease in das experimentelle Panel einbeziehen 8,9,10. Biologische Veränderungen, die auf den funktionellen Verlust des Zielgens zurückzuführen sind, werden zwischen epigenetischem Silencing und dieser alternativen Technologie geteilt.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken Angelo Amabile, Paola Capasso, Ilaria Caserta, Tania Baccega, Alice Reschigna, Valeria Mollica und Deborah Cipria für die Zusammenarbeit bei der Entwicklung der epigenetischen Silencing-Technologie im Laufe der Jahre. Dejan Lazarevic und Francesca Giannese für die kritische Überprüfung der im Protokoll beschriebenen RNA-seq- und MeDIP-seq-Analysen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse an A.L. von der Telethon Foundation (TIGET Grant Nr. F1) und dem EU Horizon 2020 Programm (UPGRADE) unterstützt. Die Illustrationen wurden mit BioRender.com erstellt.
BEITRAG DER AUTOREN
A.M., M.A.C., F.G. und A.C. trugen zur Gestaltung des Protokolls und zum Schreiben des Manuskripts bei; S.V., I.M. und D.C. entwarfen die bioinformatischen Abschnitte des Protokolls und überarbeiteten das Manuskript; A.M. und A.L. entwarfen das Protokoll, konzipierten und schrieben das Manuskript mit dem Input aller Autoren.
4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | DNA quantification |
4D-Nucleofector X Unit | Lonza Bioscience | AAF-1003X | Nucleofection |
B2M silencing gRNA #1 | Lombardo's lab | GCAATCAGGACAAGGCCCGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #2 | Lombardo's lab | GGGGTAGGAGAGACTCACGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #3 | Lombardo's lab | GAGTCCAGGGCTGGATCTCG | Gene silencing |
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion | Fluorescence Activated Cell Sorting |
bedtools | Bedtools | http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Processing of genomic intervals |
bwa | Ih3 | https://github.com/lh3/bwa | Alignment of MeDIP-seq reads |
Chopchop | Valen's lab | http://chopchop.cbu.uib.no/ | gRNA selection software |
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine | Corning | 10-040-CV | Cell culture |
cqn | Bioconductor | http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html | Region-wise normalization by GC-content |
CRISPR design suite | Zhang's lab | https://zlab.bio/resources-2 | off-target gRNA binding prediction |
CRISPRoff-v2.1 plasmid | Addgene | 167981 | Gene silencing |
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer | Beckman Coulter | C01161 | Flow cytometry |
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab |
ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt |
Genetic engineering |
E220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500239 | DNA sonication |
edgeR | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html | Differential abundance testing |
EnGen Mutation Detection Kit | NEB | E3321 | Gene disruption quantification |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Cell culture |
Flowjo | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | Flow cytometry data analysis software |
Gel Loading Dye, Purple (6x) | NEB | B7024S | DNA gel loading |
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase | Promega | M7401 | PCR amplification |
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AGGCTACTAGCCCCATCAAG | Genetic engineering |
hCas9 plasmid | Addgene | 41815 | Genetic engineering |
High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent | 5067-5585 | DNA quantification |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | DNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | RNA quantification |
IPure kit | Diagenode | C03010011 | Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product |
K-562 cells | ATCC | CCL-243 | Cell engineering |
KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 | MeDIP-Seq libraries preparation |
MACS2 | Taoliu | https://github.com/macs3-project/MACS | Identification of methyl-enriched regions |
MagMeDIP kit | Diagenode | C02010020 | 5-methylcytosine immunoprecipitation |
NextFlex Methylseq kit 1 | Bioo Scientific | 5118-01 | MeDIP-Seq libraries preparation |
NextSeq 500 / NovaSeq 6000 | Illumina | SY-415-1002 / 20012850 | Next Generation Sequencing |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-nagel | 740410.50 | Midiprep plasmid preparation |
One Shot TOP10 Chemically Competent cells | ThermoFisher | C404010 | Plasmid transformation |
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid | Addgene | 48240 | Gene activation |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Cell culture |
phU6.sgRNA plasmid | Addgene | 53188 | Genetic engineering |
PowerPac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | Agarose gel electrophoresis |
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | GTATTTGCTGGTTATGTTAG | Genetic engineering |
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AATGGTTGAGTTGGAC | Genetic engineering |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | DNA extraction |
Qubit | Thermo Fisher | Q33238 | DNA quantification |
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | DNA quantification |
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32852 | RNA quantification |
Restriction enzymes | NEB | DNA digestion | |
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74106 | RNA extraction |
Rsubread | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html | Quantification of gene expression |
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza Bioscience | V4XC-2032 | Nucleofection |
SnapGene | Dotmatics | https://www.snapgene.com/ | Molecular biology design software |
STAR | Alexander Dobin | https://github.com/alexdobin/STAR | Alignment of RNA-seq reads |
T100 Thermal Cycler | Biorad | 1861096 | PCR amplification |
T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | DNA ligation |
TAE Buffer | Fisher scientific | BP1332500 | Agarose gel electrophoresis |
TruSeq Stranded Total RNA kit | Illumina | 20020597 | RNA-Seq library preparation |
UltraPure Agarose | ThermoFisher | 16500500 | Agarose gel |