Summary

קביעת קינטיקה במבחנה והפעלה תאית עבור אפטאמרים של RNA פלואורוגניים

Published: August 09, 2022
doi:

Summary

הפרוטוקול מציג שתי שיטות לקביעת הקינטיקה של הרנ”א הפלואורוגני אפטאמרים תרד2 וברוקולי. השיטה הראשונה מתארת כיצד למדוד קינטיקה פלואורוגנית של אפטמר במבחנה באמצעות קורא צלחת, ואילו השיטה השנייה מפרטת את מדידת הקינטיקה הפלואורוגנית של אפטמר בתאים על ידי ציטומטריה של זרימה.

Abstract

אפטאמרים פלואורוגניים של RNA יושמו בתאים חיים כדי לתייג ולהמחיש רנ”א, לדווח על ביטוי גנים ולהפעיל ביוסנסורים פלואורסצנטיים המזהים רמות של מטבוליטים ומולקולות איתות. על מנת לחקור את השינויים הדינמיים בכל אחת מהמערכות הללו, רצוי לקבל מדידות בזמן אמת, אך דיוק המדידות תלוי בקינטיקה של התגובה הפלואורוגנית שתהיה מהירה יותר מתדר הדגימה. במאמר זה נתאר שיטות לקביעת הקינטיקה החוץ-גופית והתאית עבור אפטאמרים פלואורוגניים של RNA באמצעות קורא צלחות המצויד במזרק דגימה וציטומטר זרימה, בהתאמה. אנו מראים כי ניתן למדל את הקינטיקה במבחנה עבור הפעלת הפלואורסצנציה של האפטמרים תרד2 וברוקולי כתגובות אסוציאציה דו-פאזיות ויש להם קבועי קצב פאזה מהירים שונים של 0.56 s−1 ו- 0.35 s−1, בהתאמה. בנוסף, אנו מראים כי הקינטיקה התאית להפעלת פלואורסצנטיות של תרד2 ב-Escherichia coli, המוגבלת עוד יותר על ידי דיפוזיית צבע לחיידקים גראם-שליליים, עדיין מהירה מספיק כדי לאפשר תדירות דגימה מדויקת על ציר הזמן הדק. שיטות אלה לניתוח קינטיקה של הפעלת פלואורסצנציה ישימות לאפטמרים פלואורוגניים אחרים של RNA שפותחו.

Introduction

תגובות פלואורוגניות הן תגובות כימיות היוצרות אות פלואורסצנטי. אפטאמרים פלואורוגניים של RNA בדרך כלל מבצעים את הפונקציה הזו על-ידי קשירת צבע מולקולה קטנה כדי לשפר את התפוקה הקוונטית הפלואורסצנטית שלה (איור 1A)1. פותחו מערכות אפטמר RNA פלואורוגניות שונות המורכבות מרצפי RNA אפטמר ספציפיים ומליגנדות הצבעהמתאימות 1. אפטאמרים של RNA פלואורוגניים צורפו לתעתיקי RNA כתגי פלואורסצנט המאפשרים הדמיה של תאים חיים של mRNA ו-RNAsשאינם מקודדים 2,3,4. הם גם הוצבו לאחר רצפי מקדמים כמדווחים פלואורסצנטיים של ביטוי גנים, בדומה לשימוש בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כמדווח, אלא שפונקציית הדיווח היא ברמת RNA 5,6. לבסוף, אפטאמרים של RNA פלואורוגניים שולבו בביוסנסורים פלואורסצנטיים מבוססי RNA, שנועדו לעורר את התגובה הפלואורוגנית בתגובה למולקולה קטנה ספציפית. ביוסנסורים פלואורסצנטיים מבוססי RNA פותחו להדמיית תאים חיים של מטבוליטים שונים שאינם פלואורסצנטיים ומולקולות איתות 7,8,9,10,11.

יש עניין גובר בפיתוח אפטמרים של RNA פלואורוגניים כדי לדמיין שינויים דינמיים בלוקליזציה של RNA, ביטוי גנים ואותות של מולקולות קטנות. עבור כל אחד מהיישומים הללו, רצוי לקבל מדידות בזמן אמת, אך הדיוק של המדידות תלוי בקינטיקה של התגובה הפלואורוגנית להיות מהירה יותר מתדר הדגימה. במאמר זה נתאר שיטות לקביעת הקינטיקה במבחנה עבור רנ”א פלואורוגני אפטאמרים תרד2 12 וברוקולי13 באמצעות קורא צלחות המצויד במזרק דגימה ולקביעת הקינטיקה הדלקתית התאית עבורתרד2 המתבטאת ב-Escherichia coli באמצעות ציטומטר זרימה. שני אפטאמרים אלה של RNA נבחרו מכיוון שהם יושמו כדי לחקור לוקליזציה של RNA 2,3,4, הם שימשו בכתבים 5,6 וביוסנסורים 7,8,9,10,11, וליגנדות הצבע המתאימות (DFHBI או DFHBI-1T) זמינות מסחרית. סיכום של תכונותיהם במבחנה שנקבעו בספרות מובא בטבלה 1 4,13,14, אשר ביססה את התפתחות הפרוטוקול (למשל, אורכי הגל וריכוזי הצבעים שבהם נעשה שימוש). תוצאות אלה מראות כי התגובות הפלואורוגניות המושפעות מאפטאמרים של RNA הן מהירות ואינן אמורות לעכב מדידות מדויקות עבור היישומים הביולוגיים הרצויים של התא.

Protocol

1. ניסוי קינטיקה במבחנה הכנת תבניות DNA על ידי PCRהגדר תגובות PCR: כדי להכין תגובות PCR, שלב את הריאגנטים הבאים בצינור PCR בעל דופן דקה:33 μL של מים מזוקקים כפולים (ddH2O)10 μL של מאגר 5x עבור DNA פולימראז באיכות גבוהה5 μL של 2 mM כל טריפוספט דאוקסיריבונוקלאוזיד (dNTP)0.5 μL של …

Representative Results

קינטיקה במבחנההרצפים של תבניות הדנ”א והפריימרים, שנרכשו כאוליגונוקלאוטידים סינתטיים, מוצגים בטבלה 2, ומתכוני הריאגנטים מוצגים בקובץ משלים 1. הגברת PCR משמשת להגדלת כמות תבנית הדנ”א באמצעות מקדם T7, הנדרש לתגובת השעתוק במבחנה (IVT) הבאה. בנוסף, נ?…

Discussion

עבור ניסוי הקינטיקה במבחנה, ניתן לשנות את אותו פרוטוקול כללי כדי למדוד את הקינטיקה במבחנה של ביוסנסור פלואורסצנטי מבוסס RNA המכיל גם תחום קושר ליגנד וגם תחום קושר פלואורופור 8. במקרה זה, יש לדגור את הרנ”א עם הפלואורופור לפני המדידות בעת הזרקת הליגנד על מנת לקבל קינטיק?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים ל- MCH: NSF-BSF 1815508 ו- NIH R01 GM124589. MRM נתמך חלקית על ידי מענק הכשרה NIH T32 GM122740.

Materials

Agarose Thermo Fischer Scientific BP160500
Agarose gel electrophoresis equipment Thermo Fischer Scientific B1A-BP
Alpha D-(+)-lactose monohydrate Thermo Fischer Scientific 18-600-440
Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fischer Scientific 22431021
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich A4418
Attune NxT Flow cytometer Thermo Fischer Scientific A24861
Attune 1x Focusing Fluid Thermo Fischer Scientific A24904
Attune Shutdown Solution Thermo Fischer Scientific A24975
Attune Performance Tracking Beads Thermo Fischer Scientific 4449754
Attune Wash Solution Thermo Fischer Scientific  J24974
Boric acid Sigma-Aldrich B6768
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carbenicillin disodium salt Sigma-Aldrich C3416
Chlorine Bleach Amazon B07J6FJR8D
Corning Costar 96-well plate Daigger Scientific EF86610A
Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap Globe Scientific 05-402-31
DFHBI Sigma-Aldrich SML1627
DFHBI-1T Sigma-Aldrich SML2697
D-Glucose (anhydrous) Acros Organics AC410955000
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DTT-RO
DNA loading dye New England Biolabs B7025S
DNA LoBind Tubes (2.0 mL) Eppendorf 22431048
dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP New England Biolabs N0446S
EDTA, pH 8.0 Gibco, Life Technologies AM9260G
Ethanol (EtOH) Sigma-Aldrich E7023
Filter-tip micropipettor tips Thermo Fischer Scientific AM12635, AM12648, AM12655, AM12665
FlowJo Software BD Biosciences N/A FlowJo v10 Software
Fluorescent plate reader with heating control VWR 10014-924
Gel electrophoresis power supply Thermo Fischer Scientific EC3000XL2
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Glycogen AM95010 Thermo Fischer Scientific AM95010
GraphPad Prism Dotmatics N/A Analysis software from Academic Group License 
Heat block  Thomas Scientific 1159Z11
HEPES Sigma-Aldrich H-4034
Inorganic pyrophosphatase Sigma-Aldrich I1643-500UN
Low Molecular Weight DNA Ladder New England Biolabs N3233L Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025).
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) Sigma-Aldrich M2670
Magnesium sulfate (MgSO4) Fisher Scientific MFCD00011110
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) Eppendorf 22363204
Microcentrifuge with temperature control Marshall Scientific EP-5415R
Micropipettors Gilson FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M
Micropipettor tips Sigma-Aldrich Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR
Millipore water filter with BioPak unit Sigma-Aldrich CDUFBI001, ZRQSVR3WW
Narrow micropipettor pipette tips DOT Scientific RN005R-LRS
PBS, 10x Thermo Fischer Scientific BP39920
PCR clean-up kit Qiagen 28181
PCR primers and templates Integrated DNA technologies
PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes Bio-Rad 1851148
PCR thermocycler for 0.5 mL tubes Techne 5PRIME/C
pET31b-T7-Spinach2 Plasmid Addgene Plasmid #79783
Phusion High-Fidelity DNA polymerase  New England Biolabs M0530L Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions.
Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific C.B.S. Scientific VGC-1508
Polyacrylamide gel electrophoresis equipment C.B.S. Scientific ASG-250
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Razor blades Genesee Scientific 38-101
rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP New England Biolabs N0450L
SDS Sigma-Aldrich L3771
Short wave UV light source Thermo Fischer Scientific 11758221
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich S7795
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Thermo Fischer Scientific S375-500
SoftMax Pro Molecular Devices N/A SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License
Sterile filter units Thermo Fischer Scientific 09-741-88
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
SYBR Safe DNA gel stain Thermo Fischer Scientific S33102
TAE buffer for agarose gel electrophoresis Thermo Fischer Scientific AM9869
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Tris base Sigma-Aldrich TRIS-RO
Tryptone (granulated) Thermo Fischer Scientific M0251S
T7 RNA polymerase New England Biolabs M0251S
Urea-PAGE Gel system  National Diagnostics EC-833
UV fluorescent TLC plate Sigma-Aldrich 1.05789.0001
UV/Vis spectrophotometer Thermo Fischer Scientific ND-8000-GL
Vortex mixer Thermo Fischer Scientific 2215415
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126
Yeast Extract (Granulated) Thermo Fischer Scientific BP9727-2

References

  1. Su, Y., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs. Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).
  2. Zhang, J., et al. Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells. Scientific Reports. 5, 17295 (2015).
  3. Wang, Z., et al. In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time. Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).
  4. Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA. Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).
  5. Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
  6. You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).
  7. Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).
  8. Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).
  9. Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).
  10. Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP. Nucleic Acids Research. 44 (17), 139 (2016).
  11. Paige, J. S., Thinh, N. -. D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA. Science. 335 (6073), 1194 (2012).
  12. Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
  13. Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
  14. Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach. Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).
  15. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).
  16. Basch, H., Gadebusch, H. H. In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide. Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).
  17. Kallansrud, G., Ward, B. A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients. Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).
  18. Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs. RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).
  19. Szatmári, D., et al. Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies. Scientific Reports. 10, 12002 (2020).
  20. Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD® BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
  21. Huang, H., et al. A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore. Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).
  22. Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers. RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).
  23. Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging. Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).
  24. Wang, P., et al. Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging. Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).
  25. Dao, N. T., et al. Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach. Scientific Reports. 11, 7356 (2021).

Play Video

Cite This Article
Mumbleau, M. M., Meyer, M. R., Hammond, M. C. Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers. J. Vis. Exp. (186), e64367, doi:10.3791/64367 (2022).

View Video