Fluorogene reaktioner er kemiske reaktioner, der genererer et fluorescenssignal. Fluorogene RNA-aptamerer udfører typisk denne funktion ved at binde et lille molekylefarvestof for at forbedre dets fluorescenskvanteudbytte (figur 1A)¹. Forskellige fluorogene RNA-aptamersystemer er udviklet og består af specifikke RNA-aptamersekvenser og de tilsvarende farvestofligander¹. Fluorogene RNA-aptamerer er blevet tilføjet til RNA-transkripter som fluorescerende tags, der muliggør levende cellebilleddannelse af mRNA’er og ikke-kodende RNA’er ^2,3,4. De er også blevet placeret efter promotorsekvenser som fluorescerende reportere af genekspression, svarende til brugen af grønt fluorescerende protein (GFP) som reporter, bortset fra at rapporteringsfunktionen er på RNA-niveau ^5,6. Endelig er fluorogene RNA-aptamerer blevet inkorporeret i RNA-baserede fluorescerende biosensorer, som er designet til at udløse den fluorogene reaktion på et specifikt lille molekyle. RNA-baserede fluorescerende biosensorer er udviklet til levende cellebilleddannelse af forskellige ikke-fluorescerende metabolitter og signalmolekyler 7,8,9,10,11.

Der er stigende interesse for udviklingen af fluorogene RNA-aptamerer til at visualisere dynamiske ændringer i RNA-lokalisering, genekspression og små molekylesignaler. For hver af disse anvendelser er det ønskeligt at opnå realtidsmålinger, men målingernes nøjagtighed afhænger af, at kinetikken af den fluorogene reaktion er hurtigere end prøveudtagningsfrekvensen. Her beskriver vi metoder til at bestemme in vitro-kinetikken for fluorogene RNA-aptamerer Spinat2 12 og Broccoli¹³ ved hjælp af en pladelæser udstyret med en prøveinjektor og til at bestemme den cellulære tændingskinetik for^spinat2 udtrykt i Escherichia coli ved hjælp af et flowcytometer. Disse to RNA-aptamerer blev valgt, fordi de er blevet anvendt til at studere RNA-lokalisering ^2,3,4, de er blevet brugt i journalister ^5,6 og biosensorer 7,8,9,10,11^, og de tilsvarende farvestofligander (DFHBI eller DFHBI-1T) er kommercielt tilgængelige. Et resumé af deres in vitro-egenskaber bestemt i litteraturen findes i tabel 1 4,13,14^, som dannede grundlag for protokoludviklingen (f.eks. de anvendte bølgelængder og farvestofkoncentrationer). Disse resultater viser, at de fluorogene reaktioner, der påvirkes af RNA-aptamerer, er hurtige og ikke bør hindre nøjagtige målinger for de ønskede cellebiologiske anvendelser.