Efficiënte transfectie van in vitro getranscribeerd mRNA in gekweekte cellen met behulp van peptide-poloxamine nanodeeltjes

Vaccinatie is aangekondigd als een van de meest efficiënte medische interventies voor het verminderen van de morbiditeit en mortaliteit veroorzaakt door infectieziekten¹. Het belang van vaccins is aangetoond sinds de uitbraak van coronavirusziekte 2019 (COVID-19). In tegenstelling tot het traditionele concept van het injecteren van geïnactiveerde of levend verzwakte pathogenen, concentreren state-of-the-art vaccinbenaderingen, zoals vaccins op basis van nucleïnezuur, zich op het behoud van de immuunstimulerende eigenschappen van de doelpathogenen, terwijl de potentiële veiligheidsproblemen in verband met het conventionele geheel-microbiële virus- of in op bacteriën gebaseerde vaccins worden vermeden. Zowel DNA- als RNA (d.w.z. in vitro getranscribeerd boodschapper-RNA, IVT-mRNA) -gebaseerde vaccins vertonen profylactisch tot therapeutisch potentieel tegen een verscheidenheid aan ziekten, waaronder infectieziekten en kankers ^2,3. In principe heeft het potentieel van op nucleïnezuur gebaseerde vaccins betrekking op hun productie, werkzaamheid en veiligheid⁴. Deze vaccins kunnen op een celvrije manier worden vervaardigd om kosteneffectieve, schaalbare en snelle productie mogelijk te maken.

Een enkel vaccin op basis van nucleïnezuur kan coderen voor meerdere antigenen, waardoor het doelwit van talrijke virale varianten of bacteriën met een verminderd aantal inentingen mogelijk wordt en de immuunrespons tegen veerkrachtige pathogenen wordt versterkt ^5,6. Bovendien kunnen op nucleïnezuur gebaseerde vaccins het natuurlijke invasieproces van virus- of bacteriële infectie nabootsen, waardoor zowel B-cel- als T-celgemedieerde immuunresponsen worden gebracht. In tegenstelling tot sommige virus- of DNA-gebaseerde vaccins, bieden IVT-mRNA-gebaseerde vaccins een enorm voordeel in termen van veiligheid. Ze kunnen snel het gewenste antigeen in het cytosol tot expressie brengen en zijn niet geïntegreerd in het gastheergenoom, waardoor zorgen over insertionele mutagenese^{worden weggenomen 7}. IVT-mRNA wordt automatisch afgebroken na succesvolle translatie, zodat de kinetiek van de eiwitexpressie gemakkelijk kan worden gecontroleerd ^8,9. Gekatalyseerd door de pandemie van het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), hebben inspanningen van bedrijven / instellingen over de hele wereld de introductie van vele soorten vaccins op de markt mogelijk gemaakt. Ivt-mRNA-gebaseerde vaccintechnologie toont een groot potentieel en heeft voor het eerst zijn eerder verwachte succes aangetoond, dankzij het snelle ontwerp en het flexibele vermogen om zich binnen enkele maanden aan te passen aan doelantigenen. Het succes van IVT-mRNA-vaccins tegen COVID-19 in klinische toepassingen opende niet alleen een nieuw tijdperk van onderzoek en ontwikkeling van IVT-mRNA-vaccins, maar heeft ook waardevolle ervaring opgedaan voor de snelle ontwikkeling van effectieve vaccins voor het omgaan met uitbraken van infectieziekten^10,11.

Ondanks het veelbelovende potentieel van IVT-mRNA-vaccins, blijft de efficiënte intracellulaire afgifte van IVT-mRNA op de plaats van actie (d.w.z. cytoplasma) een belangrijke hindernis vormen¹², vooral voor degenen die via de luchtwegen worden toegediend⁴. IVT-mRNA is inherent een onstabiel molecuul met een extreem korte halfwaardetijd (~ 7 h)¹³, waardoor IVT-mRNA zeer gevoelig is voor afbraak door het alomtegenwoordige RNase¹⁴. De lymfocyten van het aangeboren immuunsysteem hebben de neiging om het erkende IVT-mRNA te verzwelgen in gevallen van in vivo toepassing. Bovendien schaden de hoge negatieve ladingsdichtheid en het grote molecuulgewicht (1 x 10^4-1 x 10⁶ Da) van IVT-mRNA de effectieve permeatie ervan over de anionische lipide-bilaag van cellulaire membranen¹⁵. Daarom is een afgiftesysteem met bepaalde bio-functionele materialen nodig om de afbraak van de IVT-mRNA-moleculen te remmen en cellulaire opname^{te vergemakkelijken 16}.

Afgezien van een paar uitzonderlijke gevallen waarin naakt IVT-mRNA direct werd gebruikt voor in vivo onderzoek, worden verschillende toedieningssystemen gebruikt om IVT-mRNA naar de therapeutische plaats van actie te brengen^17,18. Eerdere studies hebben aangetoond dat slechts enkele IVT mRNA’s worden gedetecteerd in cytosol zonder de hulp van een toedieningssysteem¹⁹. Er zijn talloze strategieën ontwikkeld om de RNA-afgifte te verbeteren met voortdurende inspanningen in het veld, variërend van protaminecondensatie tot lipideninkapseling²⁰. Lipide nanodeeltjes (LNP’s) zijn de meest klinisch geavanceerde onder de mRNA-toedieningsvoertuigen, zoals blijkt uit het feit dat alle goedgekeurde mRNA COVID-19-vaccins voor klinisch gebruik gebruik maken van op LNP gebaseerde toedieningssystemen²¹. LNP’s kunnen echter geen effectieve mRNA-transfectie bemiddelen wanneer de formuleringen worden toegediend via de ademhalingsroute²², wat de toepassing van deze formuleringen opmerkelijk beperkt bij het induceren van mucosale immuunresponsen of het aanpakken van longgerelateerde ziekten zoals cystische fibrose of α1-antitrypsinedeficiëntie. Daarom is het ontwikkelen van een nieuw toedieningssysteem nodig om de efficiënte levering en transfectie van IVT-mRNA in luchtweggerelateerde cellen te vergemakkelijken om deze onvervulde behoefte op te lossen.

Het is bevestigd dat het peptide-poloxamine zelfgeassembleerde nanodeeltjes (PP-sNp) afgiftesysteem de efficiënte transfectie van nucleïnezuren in de luchtwegen van muizen kan bemiddelen²³. De PP-sNp hanteert een multifunctionele modulaire ontwerpbenadering, die verschillende functionele modules in de nanodeeltjes kan integreren voor snelle screening en optimalisatie²³. De synthetische peptiden en elektrisch neutrale amfifiele blokcopolymeren (poloxamine) in de PP-sNp kunnen spontaan interageren met IVT-mRNA om uniform verdeelde nanodeeltjes te genereren met een compacte structuur en een glad oppervlak²³. PP-sNp kan het gentransfectie-effect van IVT-mRNA-moleculen in gekweekte cellen en de luchtwegen van muizen verbeteren²³. De huidige studie beschrijft een protocol voor het genereren van PP-sNp bevattend IVT-mRNA dat codeert voor Metridia luciferase (MetLuc-mRNA) (Figuur 1). Gecontroleerd en snel mengen via een microfluïdisch mengapparaat, dat gebruik maakt van het gespreide visgraatmengontwerp, wordt in dit protocol gebruikt. De procedure is eenvoudig uit te voeren en maakt het genereren van PP-sNp met meer uniforme maten mogelijk. Het algemene doel van PP-sNp-productie met behulp van de microfluïdische mixer is om PP-sNp voor mRNA-complexatie op een goed gecontroleerde manier te creëren, waardoor efficiënte en reproduceerbare celtransfectie in vitro mogelijk is. Het huidige protocol beschrijft de voorbereiding, assemblage en karakterisering van PP-sNp met MetLuc-mRNA.